WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |

«Том I Ульяновск - 2013 Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 1 ] --

Материалы международной

научно-практической конференции

«Бактериофаги:

Теоретические и практические аспекты

применения в медицине, ветеринарии

и пищевой промышленности»

Том I

Ульяновск - 2013

Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» / - Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. I - 184 с.

ISBN 978-5-905970-14-6 Редакционная коллегия:

д.б.н., профессор Д.А. Васильев д.б.н., профессор С.Н. Золотухин д.б.н., А.В. Алешкин Технический редактор Д.Н. Хлынов Авторы опубликованных статей несут ответственность за достоверность и точность приведенных фактов, цитат, экономико-статистических данных, собственных имен, географических названий и прочих сведений, а также за разглашение данных, не подлежащих открытой публикации.

Отпечатано в типографии «Ульяновской ГСХА им. П.А.Столыпина»

432063, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

© ФГбОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», Биология фагов Биология фагов УДК 578.

СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ФАГОВЫХ

И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОГЛИКАНГИДРОЛАЗ, НОВОГО

КЛАССА АНТИСТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНЗИБИОТИКОВ

Абаев И.В., кандидат медицинских наук

, тел. 7(4967) 36-00-03, abaev@obolensk.org Скрябин Ю.П., тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org Печерских Э.И., тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org Шишкова Н.А., кандидат биологических наук, тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор, тел. 7(4967) 36-00-79, svetoch@obolensk.org ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Ключевые слова: пептидогликангидролазы, эндолизины, аутолизины, бактериальный лизис, стафилококки.

Работа посвящена анализу известных структурных типов бактериальных и бактериофаговых пептидогликангидролаз, рассматриваемых в качестве основы для разработки перспективных антистафилококковых препаратов, прежде всего, против антибиотикорезистентных штаммов. ункциональные характеристики доменов пептидогликангидролаз позволяют создание рекомбинантных белков узконаправленного спектра действия против одного или более родов грамположительных бактерий, например, только стафилококков и стрептококков.

Патогены с множественной лекарственной устойчивостью являются актуальной проблемой здравоохранения во всем мире. Бактериальные и бактериофаговые пептидогликангидролазы (ПГ) в виде очищенных рекомбинантных белков способны убивать грамположительные бактерии в результате осмотического лизиса и оцениваются как новый класс антибактериальных веществ, расщепляющих различные ковалентные связи пептидогликана бактерий. ПГ представляют собой потенциальный источник нового поколения антимикробных препаратов для лечения лекарственно-устойчивых форм возбудителей.

ПГ разрушают пептидогликан - основной компонент бактериальной стенки [1]. Характерными свойствами ПГ по сравнению с другими возможными источниками новых антибактериальных препаратов являются ) низкая вероятность возникновения резистентности патогенов к ПГ, b) узкий спектр литического действия – способность разрушать только целевые бактерии, c) эффективный лизис бактериальных биопленок.

Фаговые ПГ (эндолизины) - продукт ко-эволюция бактерий и фагов. Выживание фага основывается на его способности деградировать пептидогликан и высвобождать новые фаговые частицы. Аналогично, бактериальные ПГ (аутолизины) необходимы для обеспечения Биология фагов процессов роста клеточной стенки, деления клеток, споруляции самой бактериальной клетки.

Случаи возникновения бактериальной устойчивости к эндолизинам не были выявлены, несмотря на неоднократные попытки [2]. Вполне вероятно, что ко-эволюция бактерий и фагов сделала мишенью ПГ неизменяемые связи пептидогликана.

Родо – или даже видоспецифичность ПГ по отношению к патогенам позволяет целенаправленно воздействовать только на инфекционный агент, не затрагивая широкий спектр сопутствующей микрофлоры. Специфичность ПГ позволяет избежать многих ошибок, связанных с использованием антимикробных препаратов широкого спектра действия, которые приводят к селекции резистентных штаммов не только у целевого возбудителя, но и у комменсалов, на которые препарат воздействует. Согласно рекомендациям ВОЗ для снижения уровня распространения антибиотикорезистентности следует избегать воздействия антибиотиков широкого спектра действия на бактериальные сообщества комменсалов. ПГ, вследствие родовой и видовой специфичности, выгодно отличаются в этом отношении от антибиотиков.

Высокая степень резистентности к антибактериальным препаратам многих возбудителей и понижение их восприимчивости к фагоцитозу, как известно, обусловлена множественными изменениями в клетках патогена, сопровождающими рост биопленки. Благодаря фиксированным формам бактериальных колоний, биопленки могут закрепляться на поверхности механических или протетических устройств, или прикрепляться к слою клеток млекопитающих.

Бактерии в биопленке могут быть на несколько порядков более устойчивыми к воздействию антибиотиков, чем в жидкой культуре [3]. Использование ферментов, способных разрушать биопленки, делает более эффективным лечение стафилококковых инфекций [4]. Для стафилококковых ПГ показана эффективная способность разрушать биопленки S. ureus [5].



Перечисленные характеристики стафилококковых ПГ во многом определяются модульной структурой этих ферментов. По локализации гены стафилококковых ПГ разделяют на два типа: 1) гены эндолизинов, которые входят в состав фагов/профагов, 2) гены аутолизинов, которые локализуются в бактериальной хромосоме и плазмидах. Эндолизины и аутолизины обладают доменной структурой: один-два каталитических домена и субстрат-связывающий домен, который может быть в нескольких повторах. Организация доменной структуры имеет различные варианты по составу и локализации доменов.

По каталитической активности выделяют три основных класса ПГ стафилококков, способные расщеплять пептидные, амидные или гликозидные связи пептидогликана. Соответственно, выделяют эндопептидазные, амидазные и гликозаминидазные каталитические домены [1]. Каждый каталитический домен состоит из коротких последовательностей в 100-200 аминокислот. Среди субстрат-связывающих доменов наиболее часто встречаются два типа: SH3_5 домен и LysM домен. Для эндолизинов наиболее характерны три основных типа структуры – ) -концевая эндопептидаза (цистеин-гистидин-зависимой амидогидроконцевая лазы (CHAP) (pfm 05257; GO:0008745)), второй каталитический домен – амидаза-2 (pfm 01510; GO:0008745), и С-терминальный 3_5 домен (pfm0840); ) -концевая эндопепконцевая тидаза (CHAP) и С-терминальный SH3b_5 домен; c) -концевая эндопептидаза (CHAP) и домен гликозаминидазы (cl00743). Отсутствие в составе ряда опубликованных эндолизинов С-терминального 3_5 домена, возможно, связано со сложностями идентификации нестандартных вариантов данного домена.

Принципиальным отличием известных аутолизинов от эндолизинов является локализация эндопептидазного домена на С-конце. Всего выделяются три основных варианта структуры: ) -концевой LysM домен и С-терминальная эндопептидаза; ) С-терминальная эндопепконцевой ) тидаза без идентифицированного LysM домена; и c) домен гликозаминидазы и С-терминальная эндопептидаза.

На сегодняшний день идентифицировано, как минимум, шесть различных вариантов эндопептидазного () домена, один вариант эндопептидазного M23 домена, и два варианта амидазного домена.

Информация о наличии доменного разнообразия у ПГ стафилококков важна в свете задач по получению рекомбинантных ферментов, обладающих набором новых свойств, неприсущих природным пептидогликангидролазам. Как правило, получению новых слитых белков предшествует стадия идентификации ПГ, способных лизировать живые клетки стафилококков, и стадия делеционного анализа и идентификации функциональных литических доменов, сохраняющих активность в виде отдельных белков.

Большинство ПГ, способных лизировать живые клетки., представляют собой классический вариант эндолизина, состоящего из трех доменов – двух каталитических (CHAP и амидаза) и SH3_5 домена. Это эндолизин (LysK) фагаК, эндолизин фага phi11, эндолизин фага SH2 и эндолизин lysWMY фага M [, 5, 7, 8] и др. Структуры из двух каталитических доменов - гликозаминидазы и С-терминальной эндопептидазы, к которым относится белок вириона фага 8 и белок gp1 фага MR11, также проявляли активность против живых клеток клинических изолятов. [9;10].

Данные делеционного анализа показали исключительный вклад доменов в литическую активность эндолизинов, тогда как амидазный домен в одиночку, как правило, не имеет литической активности против живых клеток. Известен только один случай доминирующего положения амидазного домена [11], способного в виде изолированного белка эффективно убивать живые клетки стафилококков. Этот факт представляется важным в свете создания химерных белков, состоящих из трех активных синергетически действующих каталитических доменов.

Способ осуществления субстрат-специфичной функции ПГ остается неясным. Изолированные каталитические домены стафилококковых эндолизинов в полной мере сохраняют специфичность, присущую полному белку [, 7, 11]. При этом наличие субстрат-связывающего домена, как правило, мало влияет на литическую активность рекомбинантного белка, но оказывает сильное влияние на такое свойство, как растворимость. Неожиданным фактом является литическая активность против стрептококков и стафилококков рекомбинантной ПГ, полученной на основе слияния каталитического пептидазного домена из стрептококкового эндолизина и субстрат-связывающего домена стафилококкового фага [12]. Таким образом, функциональные характеристики доменов ПГ позволяют создание рекомбинантных белков узконаправленного спектра действия против одного или более родов грамположительных бактерий, например, только стафилококков и стрептококков.

Терапевтический потенциал ряда стафилококковых рекомбинантых ПГ уже продемонстрирован результатами экспериментов на мышах in vivo [10; 13, 14]. Защитное действие новых антимикробных препаратов in vivo свидетельствует о высоком потенциале слитых белков, обладающих антимикробным действием, в качестве новых терапевтических средств лечения инфекций, вызванных MR, а также других стафилококковых заболеваний.

1. Lopez R, Grci E. Recent trends on the moleculr iology of pneumococcl cpsules, lytic enzymes, nd cteriophge // FEM Microiol Rev, 2004; 28: 553-580.

2. Fischetti V. Bcteriophge lytic enzymes: novel nti-infectives // Trends Microiolб 2005; 13: 491-49.

3. moren B, Grci E, Monzon M, Leiv J, Oteiz, erez M, lrt JL, ernndezYgo J. ntiiotic susceptiility ssy for tphylococcus ureus in iofilms developed in vitro // J ntimicro hemother, 1999; 44: 43-55.





4. Otto M. Bcteril evsion of ntimicroil peptides y iofilm formtion // urr Top Microiol Immunol, 200; 30: 251-258.

5. ss, Bierum G. Lytic ctivity of Recominnt Bcteriophge {phi}11 nd {phi} Endolysins on Whole ells nd Biofilms of tphylococcus ureus // ppl Environ Microiol, 2007;

73, 347-352.

Биология фагов. Becker, Dong, Bker JR, Foster-Frey J, ritchrd DG, Donovn DM. LysK endopeptidse domin is required for lysis of live stphylococcl cells // FEM Microiology letters, 2009; 294, 52-0.

7. chmelcher M, Koroov O, chischkov, Kiselev, Kopylov, rymchuk, Donovn DM, ev I. mi prophge 2 endolysin relies on cysteine, histidine-dependent midohydrolses/peptidses ctivity for lysis ‘from without’ // J Biotechnol, 2012;12(2-3):289-98.

8. Yokoi KJ, Kwhigshi, Uchid M, ughr K, hinohr M, Kwski K, kmur, Tketo & Kodir K. The two-component cell lysis genes holWMYnd lysWMYof the tphylococcus wrneri M phge vr phiWMY: cloning, sequencing, expression, nd muttionl nlysis in Escherichi coli // Gene, 2005; 351: 97–108.

9. Tkc M, nd Blsi U. hge 8 Virion-ssocited rotein 17 Displys ctivity ginst linicl Isoltes of tphylococcus ureus // Microiology. ntimicro gents hemother, 2005;49(7): 2934–2940.

10. Rshel, M., J. Uchiym, I. Tkemur,. oshi, T. Ujihr,. Tktsuji, K. onke, nd. Mtsuzki. Til-ssocited structurl protein gp1 of phge phi MR hs ifunctionl lytic ctivity // FEM Microiol. Lett, 2008; 284:9-1.

11. ev I, Foster-Frey J, Koroov O, hishkov, Kiselev, Kopylov, rymchuk, chmelcher M, Becker, Donovn DM. tphylococcl hge 238 endolysin is lytic for tphylococcus ureus nd hrors n inter-lytic-domin secondry trnsltionl strt site // ppl Microiol Biotechnol, 2012; [Epu hed of print] 12. Becker, Foster-Frey J, todol J, ncker D, Donovn DM. Differentilly conserved stphylococcl 3_5 cell wll inding domins confer incresed stphylolytic nd streptolytic ctivity to streptococcl prophge endolysin domin // Gene, 2009; 443:32– 41.

13. Dniel, Euler, ollin M, hhles, Gorelick KJ, Fischetti V. ynergism etween novel chimeric lysin nd oxcillin protects ginst infection y methicillin-resistnt tphylococcus ureus // ntimicro gents hemother, 2010; 54(4):103-12.

14. Fenton M, sey G, ill, Ghn G, Ross R, Mculiffe O, O’Mhony J, Mher F, offey. The truncted phge lysin (k) elimintes tphylococcus ureus in the nres of mice // Bioeng Bugs, 2010; 1():404-407.

SYSTEM ANALYSIS OF GENETIC STRUCTURE OF PHAGE

AND BACTERIAL PEPTIDOGLYCAN HYDROLASES, A NEW CLASS

OF ANTISTAPHYLOCOCCAL ENZYBIOTICS

Abaev IV, Skryabin YuN, Pechrskich EI, Shishkova NA, Svetoch EA d bi f dving nv nimibi gin i i gin MRA. Fnin i f idgn d dmin w digning nw mbinn ifi in gin n v gn f gm-iiv bi,.g. gin i nd i n.

УДК 578:612.017.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ ПЕПТИДНЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ

ИЗУЧЕНИЯ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ

ВИЧ-1 АНТИТЕЛАМИ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ Z13E1,

Ильичев А. А., Чикаев А. Н., Щербаков Д. Н., Федина Н. В., ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская обл., 630559, Россия Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение 8278 от 10.08.12), РФФИ (грант № 12-04-91452-НИЗ_а и грант № 12-04-31948 мол_а) Ключевые слова: фаговый дисплей, эпитопы, антитела, фаовые пиптидные библиотеки Благодаря работам Дж.Смита в 1985 г. и А. Ильичева в 1989 г. был разработан метод, впоследствии названный фаговым дисплеем, который основан на способности нитчатых бактериофагов М13 экспонировать на поверхности вириона случайные пептидные последовательности в составе белка p3 или p8 без потери инфекционности [1, 2].

Фаговый дисплей получил свое развитие как мощный метод для изучения белок-белковых взаимодействий, обеспечивающий прямую физическую связь между пептидной последовательностью, экспонированной на поверхности бактериофага и фрагментом ДНК, кодирующий данный пептид в фаговом геноме. Комбинаторные фаговые библиотеки состоят из бактериофагов, в ген оболочечных белков которых встраиваются случайные (рандомизированные) олигонуклеотидные последовательности определенной длины. В результате получается пул (библиотека) бактериофагов, экспонирующих рандомизованные последовательности аминокислот в составе одного из поверхностных белков. Библиотеки используются для селекции специфических фагов, взаимодействующих с целевым лигандом. По окончании последнего раунда селекции полипептиды, экспрессированные на поверхности фага, могут быть идентифицированы путем секвенирования ДНК индивидуальных клонов [3].

Технология фагового дисплея достаточно экономична и не требует дорого оборудования, однако при этом позволяет решить вопросы, которые не всегда удается решить с помощью рентгеноструктурного анализа [4].

Одним из интересных применений технологии фагового дисплея является идентификация эпитопов, узнаваемых антителами, обладающими повышенной эффективностью нейтрализовать вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Эти особые антитела были обнаружены у ВИЧ-инфицированных долгожителей относительно недавно и были названы нейтрализующими антителами широкого спектра действия [5]. В настоящее время известно несколько десятков таких антител. Среди них особый интерес представляют моноклональные антитела (МКА) 13e1, VR03 и VR01, для которых показана нейтрализующая активность в отношеe1, нии 91 % всех известных штаммов ВИЧ-1 [].

Цель исследования – получить пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, взаимодействующих с антителами 13e1, VR03 и VR01, с использованием фаговых пептидных библиотек.

Биология фагов Моноклональные антитела (МКА) VR01, VR03 и 13e1 были получены в рамках программы I ID Reserch nd Reference rogrm (США). В работе использовались коммерческие фаговые библиотеки h.D-12, h.D-7, h.D-c7c hge Disply eptide Lirry Kit («ew Englnd Biols», США). Данные наборы содержат комбинаторную библиотеку случайew », ных пептидных фрагментов длиной 12 или 7 аминокислотных остатков соответственно, объединенных с минорным белком оболочки pIII фага M13. Библиотека содержит приблизительно 3 109 индивидуальных фаговых клонов.

Аффинная селекция фаговых пептидных библиотек проводилась в соответствии с протоколом, описанным в руководстве к наборам фаговых библиотек («ew Englnd Biols», США). Проводилось три цикла аффинной селекции, после чего из отобранных индивидуальных бактериофагов выделялась ДНК (в соответствии с рекомендациями производителя фаговой библиотеки) и определялась ее нуклеотидная последовательность. Секвенирование проводили по методу Сэнгера в центре секвенирования ДНК ИХБФМ СО РАН. Иммуноблотинг (дот блот) бактериофагов с соответствующими МКА проводили по методике, описанной в статье [3].

Для определения соответствия между отобранными последовательностями пептидов и антигеном gp120 использовались сервер epitope (http://pepitope.tu.c.il/) и собственное программное обеспечение. Также использовалась разработанная нами программа pdMp, написанная на языке python с использованием библиотеки Bioython [7]. Она реализует аналогичный метод, но вместо пар остатков используются отдельные остатки, а район поиска эпитопа на антигене задается пользователем.

Результаты и обсуждения Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ-1, узнаваемые МКА VRC МКА VR01 принадлежат к классу IgG1, несут легкую цепь типа (каппа) и взаимодействуют с областью белка gp120, являющейся сайтом связывания вируса с D4-клетками.

VR01 обладают нейтрализующей активностью против большинства субтипов ВИЧ-1 [].

Отбор фаговых клонов, специфично связывающихся с антителами VRC01. Методика аффинной селекции (биопэннинг) позволяет отбирать из пептидной библиотеки бактериофагов те из них, которые несут пептиды, обладающие наибольшим сродством к молекулам-мишеням. На первом этапе МКА иммобилизуются на пластиковой поверхности планшетов, после чего к ним добавляется фаговая пептидная библиотека. Далее, после наступления кинетического равновесия, несвязавшиеся с антителами фаги отмываются промывочным буфером, оставшиеся специфично связанные фаговые клоны элюируются и размножаются для нового цикла селекции. Обычно достаточно проведения трех раундов аффинной селекции, чтобы получить обогащенную популяцию фагов, содержащих целевые последовательности. Из обогащенной таким образом фаговой библиотеки после проведения нескольких раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют специфичность их связывания с соответствующими МКА с помощью ИФА или иммуноблоттинга. Аминокислотный состав специфичных к МКА пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, определяют путем секвенирования фаговых ДНК в кодирующей пептид области.

Было проведено два независимых эксперимента, включающих 3 раунда аффинной селекции, с использованием антител VR01 и библиотеки h.D-12. В результате отобраны индивидуальные фаговые клоны и определены структуры их рандомизированных вставок (табл.1).

Таблица 1 - Аминокислотные последовательности, узнаваемые МКА VRC01, отобранные из фаговых пептидных библиотек. Цветом выделены совпадающие аминокислотные остатки (общие структурные мотивы) Номер фагового Характеристика антигенных свойств отобранных клонов. Специфичность связывания выделенных бактериофагов с МКА подтверждали с помощью дот-блот анализа. Результаты взаимодействия фаговых клонов с МКА VR01 представлены на рис. 1. Показано, что фаготопы № 15, 1, 2, 28, 3, 42, 49, 3 и 5 связываются с МКА VR01 c наибольшей аффинностью. Большинство полученных фаговых клонов экспонируют пептиды, которые содержат общий мотив вида UOXXJUXXWXXX, где X – любой аминокислотный остаток; U – гидрофобный неароматический (Leu, Ile либо Vl); O – er либо Thr; J – отрицательно заряженный (sp либо Glu).

Биология фагов Рис. 1 - Иммуноблот-гибридизация исследуемых фаговых клонов с антителами VRC01.

На нитроцеллюлозную мембрану наносили последовательные пятикратные разведения фаговых частиц, суспендированных в 2 мкл B Идентификация района связывания пептидов с VRC01. С целью определения возможного района связывания пептидов с VR01 нами проанализирована структура комплекса антитела VR01 с gp120, которая получена методом рентгеноструктурного анализа. В данном комплексе в структуре gp120 отсутствуют петли V3 и V1 / V2, так как они препятствуют кристаллизации gp120. В состав эпитопа входят следующие фрагменты gp120: остатки 123, 124 и 198 (остаток 198 в структуре следует непосредственно за 124, это район удаленной петли V1 / V2), районы 27–283 (петля D), 35–371 (D4-связывающая петля), 427–430, 455–474 (петля V5). Мы предположили, что найденные методом фагового дисплея пептиды способны имитировать какие-либо фрагменты эпитопа VR01 на поверхности gp120.

Сервер epitope не смог правильно определить соответствие пептидов и gp120, все найденные варианты лежали за пределами известного эпитопа. Причиной этого могут быть особенности структуры эпитопа либо пептидной библиотеки.

Программа pdMp обнаружила наилучшее соответствие консенсусной последовательности пептидов с gp120 в районе D4-связывающей петли. Поиск соответствующего района gp120 был изначально ограничен остатками, входящими в состав эпитопа антитела VR01.

На рис. 2 представлено выравнивание фрагмента gp120 c пептидами из клонов, взаимодействие которых с VR01 подтверждено методом иммуноблоттинга. В литературе отмечено, что остатки sp38 и Ile371 входят в число пяти ключевых остатков, вносящих наибольший вклад в связывание gp120 с VR01 (Wu et l., 2012). Эпитоп VR01 не включает в себя ни одного бокового радикала триптофана, фенилаланина или тирозина, поэтому С-концевая половина пептидов XXWXXX, по всей видимости, не имитирует районы gp120, а связывается с антителом каким-то другим образом.

Рис. 2 - Выравнивание пептидов из клонов, показавших наибольшую аффинность связывания в иммуноблотинге с VRC01 и фрагмента 365-371 gp120.

Выделены а.о., соответствующие консенсусной последовательности Чтобы подтвердить возможность связывания пептидов с антителом VR01 в районе взаимодействия с D4-связывающей петлей, нами построена модель фрагмента пептида VWELYKWTW из наиболее распространенного клона отобранного в результате аффинной селекции. В результате выявлено, что фрагмент WEL способен имитировать район 35– gp120 без каких-либо стерических ограничений (рис. 3).

Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ-1, узнаваемые МКА VRC С использованием антител VR03 в качестве молекулы-мишени после проведения процедуры аффинной селекции из пептидных библиотек h.D-12, h.D-C7C и h.D-7 было отобрано 8, 20 и 12 фаговых клонов соответственно. Секвенирование и последующий компьютерный анализ с использованием онлайн инструмента MimoDB позволили выявить уникальные аминокислотные последовательности среди пептидов, полученных с помощью всех трех библиотек (табл. 2). При сравнении пептидных последовательностей, полученных с помощью библиотек h.D-12 и h.D-C7C были выявлены критические для связывания аминокислоты (ro) иL(Leu).Таким образом, общий мотив выглядит следующим образом: (ro), X, L(Leu)/V(Vl). В результате аффинной селекции из библиотеки h.Dбыл получен несколько отличный мотив вида (ro)/L(Leu)/(l), W(Trp), Y(Tyr), K (Lys)/R(rg), L(Leu)/V(Vl)/I(Ile), (ro). При сравнении пептидных последовательностей, полученных с помощью библиотек h.D- и h.D-C7C были выявлены критические для связывания аминокислоты (ro) и L(Leu).

Т.о., общий мотив выглядит следующим образом: (ro), X, L(Leu)/V(Vl). В результате аффинной селекции из библиотеки Рис. 3 - Модель взаимодействия h.D-7 был получен несколько отличный моD- K (Lys)/R(rg), L(Leu)/V(Vl)/I(Ile), (ro).

Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ- виде линии, соединяющей атомы основной В результате аффинной селекции с вые радикалы, пептид изображен толстой использованием антител 13e1 было отобрано полупрозрачной линией.

Биология фагов Таблица 2 - Уникальные аминокислотные последовательности, полученные для моноклонального антитела широкого спектра действия VRC 12 мерная библиотека с7с мерная библиотека 7 мерная библиотека 0 фаговых клонов из библиотеки h.D-12 и 10 клонов из h.D-7. Секвенирование и послеD- дующий компьютерный анализ позволили выявить уникальные аминокислотные последовательности среди пептидов, полученных с помощью этих библиотек (табл. 3). Специфичность связывания всех полученных бактериофагов с МКА 13e1 подтверждали с помощью Вестернблот анализа. Результаты взаимодействия антител и фаговых клонов, отобранных в результате аффинной селекции из библиотеки h.D-12, приведены на рис. 4. В результате было показано, что из всех фаготопов c наибольшей аффинностью с МКА 13e1 связываются фаги №№1, 7, 9 3, 23, 2, 28, 25, 37, 24, полученные в результате проведения биопэннинга с использованием фаговой библиотеки h.D-12. При сравнении пептидных последовательностей был выявлен мотив длиной а.о. следующего вида: (sn), Y(Tyr)/W(Trp), X, D(sp), I(Ile)/L(Leu)/V(Vl), T(Thr). Полученную пептидную последовательность сравнили с литературными данными об аминокислотной последовательности эпитопа на поверхности gp41, с которым связывается МКА 13e1 [8].

Таблица 3 - Уникальные аминокислотные последовательности, полученные для моноклонального антитела широкого спектра действия Z13e Рис. 4 - Результат Вестерн-блот анализа фаговых клонов с антителами Z13e1.

На нитроцелюллозную мембрану наносили последовательные десятикратные разведения фаговых частиц, суспендированных в 2 мкл PBS. В качестве отрицательного контроля был использован бактериофаг №8, не содержащий искусственную пептидную встройку.

Данный эпитоп является линейным, в его состав входят следующие а.о. : WWFDIT.

Было обнаружено, что последовательность gp41 ВИЧ-1 почти полностью совпадает с мотивом отобранных фаговых пептидов. Единственным заметным отличием отбираемых фаговых пептидов является очень низкая встречаемость F (фенилаланина) в позиции между W и D. В то же время в данной позиции он присутствует в пептидных встройках, экспонированных в составе поверхностного белка фаговых частиц. Возможно, это связано с тем, что регион gp находится в альфа-спиральной конформации, и данный аминокислотный остаток находится на противоположной стороне альфа-спирали, максимально удаленной от антигенсвязывающего участка антитела. Поэтому нахождение в этой позиции фенилаланина не является строгим.

Эти результаты свидетельствуют о том, что с использованием фагового дисплея получены пептиды имитаторы эпитопа gp 41, с которыми связывается МКА 13e1.

1. mith G.. Filmentous fusion phge: novel expression vectors tht disply cloned ntigens on the virion surfce // cience. – 1985. – V. 228(4705). –. 1315–1317.

2. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев Н.Н., Ерошкин А.М., Петренко В.А., Сандахчиев Л.С. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным чужеродным пептидом в основной белок оболочки // Доклады Академии Наук. – 1989. – Т.307.

- 481-483.

3. mith G.., cott J. K. Lirries of peptides nd proteins displyed on filmentous phge // Methods in enzymology. 1993. Vol. 217.. 228–257.

4. oll-zner. Identifying epitopes of IV-1 tht induce protective ntiodies // t.

Rev. Immunol. 2004. Vol. 4, № 3.. 199–210.

5. Mscol J. R., Montefiori D.. The Role of ntiodies in IV Vccines // nnul Review Immunology. 2010. Vol. 28.. 413–444.

. Wu X., Wng., O’Dell., Li Y., Keele B. F., Yng., Immichi., Dori-Rose., oxie J.., onnors M., hw G. M., Wytt R. T., Mscol J. R. election ressure on IV-1 Envelope y Brodly eutrlizing ntiodies to the onserved D4-Binding ite // J. Virol. 2012. Vol.

8, № 10.. 5844–585.

7. ock. J., nto T., hng J. T., hpmn B.., ox. J., Dlke., Friederg I., melryck T., Kuff F., Wilczynski B., oon M. J. de. Biopython: freely ville ython tools for computtionl moleculr iology nd ioinformtics // Bioinformtics. 2009. Vol. 25, № 11.. 1422–1423.

8. wick M.B., Bonnycstle L.L., Menendez., Irving M.B., Brs.F. 3rd, rren.W., Биология фагов Burton D.R., cott J.K. Identifiction nd chrcteriztion of peptide tht specificlly inds the humn, rodly neutrlizing nti-humn immunodeficiency virus type 1 ntiody 12 // J. Virol. – 2001. – V. 75(14). -. 92-9.

УДК 578.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ

БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБРАЗЦОВ КАРТОФЕЛЯ

Андрийчук Е.Н., кандидат биологических наук Киевский национальный университет им. Тараса Шевченка, Украина +380675045549, aom502@ukr.net Ключевые слова: Бактериофаги, фитопатогенные бактерии, литическая активность, БОЕ.

Работа посвящена исследованиям фагов фитопатогенных бактерий Х. xndi v. bi 7325, Pdmn fln 8573, Pnibi mx 9034 с целью изучения их влияния на патогенную микрофлору. Изучено морфологию негативных колоний, определен спектр литической активности фагов до 20 штаммов бактерий. За особенностями строения фаги были отнесены к таксономическим группам.

Введение. При выращивании и хранении сельскохозяйственных продуктов специалисты постоянно сталкиваются с проблемой поражения растений бактериальными заболеваниями. В связи с длительным использованием химических средств для защиты растений в Украине, чрезвычайно важной является задача разработки новых, экологически чистых средств защиты растений. Традиционные методы химической защиты растений не позволяют избирательно воздействовать на отдельные микроорганизмы, не уничтожая нормальную микрофлору агроценозов. Бактериофаги (вирусы бактерий) не имеют этого существенного недостатка. Проявляя специфичность и поражая только определенные группы бактерий, фаги предотвращают как распространение инфекционных заболеваний у растений, так и истощение черноземов.

Внедрение новой экологически обоснованной системы ведения сельского хозяйства и защиты растений является важной научной задачей, что позволит получить полноценную конкурентоспособную продукцию сельскохозяйственного производства без остатков ядохимикатов. Их основным преимуществом является безопасность для человека и окружающей среды, а также более дешевое производство.

Целью работы было - получить и охарактеризовать изоляты фагов к бактериям - патогенов olnum tuerosum и проведение их сравнительного анализа для дальнейшей разработки высокоэффективного и экологически безопасного антибактериального препарата на основе вирусов микроорганизмов для борьбы с бактериальными болезнями растений.

Материалы и методы исследований. Объектом исследований были изоляты фагов, выделены к Х. xndi v.bi 7325- туберкулез сахарной свеклы; Pdmn fln 8573- мягкая гниль; Pnibi mx 9034 - гниль картофеля. В работе использовали индикаторные культуры фитопатогенных бактерий, полученных из коллекции музея Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, отдела фитопатогенных бактерий (штаммы: Х. xndi v. вi 7325; Pdmn fln 8573; Pnibi mx 9034; Cvib miignni m. dni 7750;

Ewini v (Pbim vm) 8982; Ewini v b. аi (Pbim vm b. im 844); Pdmn ing v. bi 223;

Ewini v 21; Pdmn ing v. fin1025; Pdmn ing v. -Pdmn ing v. bi 84; Pdmn i 812; Bkdi gdii v. i 8494; Pdmn vni v. i 4228; Pdmn vni v. i 4013; Pdmn viidiflv 887; Pdmn ing v. 8545;

Pdmn ing v. ing 853; Cvib miignni m. dni 7750;

Ewini v b. i 844.

Чистые линии бактериофагов получали путем шестикратного пассирования с использованием методом выкалывания отдельных негативных колоний. Были получены изоляты бактериофагов, которые использовали в дальнейшем для работы.

Для выращивания бактерий и титрования фагов использовали готовые коммерческие агаризованные питательные среды, на основе рыбного гидролизата. Разведение фагов проводили на 0,9% растворе l (физиологический раствор) или коммерческом мясном бульоне, приготовленном согласно инструкции предприятия-изготовителя. Титр определяли по Грациа и методом spot-test в бляшкообразующих единицах на мл (БОЕ / мл).

Концентрирования и очистку фагов проводили методами высокоскоростного центрифугирования в градиенте плотности sl. Дальнейшая очистка вируса (от остатков цезия sl) проводилась методом дифференциального центрифугирования.

Контроль чистоты выделенных вирусных препаратов определяли спектрофотометрическим, электронномикроскопическим методами. Электронномикроскопический анализ образцов проводили по общепринятым методикам.

Морфологию вирусных частиц изучали с помощью электронного микроскопа Jeol JEM - 1400. Препараты готовили методом негативного контрастирования уранилацетатом.

Анализ електроннограмм показал, что исследуемые фаги отличались по строению вирионов и размеру.

Результаты исследований и их обсуждение.

Выделение бактериофагов проводили с проб корнеплодов картофеля, которые отбирали из отдельных овощехранилищ разных регионов Украины. Бактериофаги выделяли до фитопатогенных бактерий семейств Pdmn, Pnibi, Xnmn. Выбор индикаторных культур был обусловлен высоким удельным весом фитопатогенных бактерий этих семейств среди возбудителей, вызывающих болезни картофеля.

Образцы отбирали из клубней картофеля за характерными симптомами бактериального заболевания. В основном бактериальные болезни проявляются во время хранения. И именно поэтому образцы отбирали после хранения их в овощехранилищах. При поражении картофель размягчается и увлажняется, превращаясь в слизистую массу темно-бурой или розовой окраски с неприятным запахом. В хранилище заболевание чаще наблюдается в верхнем слое (20 - 25 см), где сохраняется повышенная влажность воздуха. Болезнь обостряется при резких колебаниях температуры, повышенной влажности воздуха, переохлаждении или подмораживании клубней, механическими повреждениями, а также при заражении их другими болезнями - бурой бактериальной гнилью, черной ножкой, мягкой гнилью, кольцевой гнилью. Для предотвращения заболевания необходимо своевременно и бережно убирать продукцию, тщательно отбирать здоровый посадочный материал и поддерживать оптимальный режим хранения.

В отдельных агроценозах было обнаружено колебание эффективности выделения фагов по числу положительных проб в зависимости от региона. О распределении положительных результатов по регионам Украины, то можно акцентировать, что бактериофаги к Pnibi Биология фагов mx 9034 и Pdmn fln 8573 встречались чаще других. К бактерии Х.

xndi v.bi 7325 было обнаружено лишь один положительный результат.

Кроме этого, еще было замечено сильное колебание биологической активности выделения бактериофагов из природных биоценозов. Было очень тяжело выделить из почвы изоляты фагов. Этот факт свидетельствует о низкой вероятности распространения и сохранения популяции бактериофагов именно в почве. Это может объясняться коротким сроком хранения бактерий в почве и применением севооборотов на опытных полях [1].

Для получения чистых линий проводили не менее шести пассажей.

Сравнительная характеристика титров бактериофагов проводили с помощью тест культур (Х. xndi v.bi 7325; Pdmn fln 8573; Pnibi mx 9034, проведенных по разным методикам: титрование по Грация и титрования методом spottest.

Для дальнейшей работы были отобраны образцы с определенными симптомами гнили - кольцевая гниль картофеля, мягкая гниль.

Изучены и исследованы негативные колонии бактериофагов, которые были получены в лаборатории, различались по размерам, особенностями морфологии и скорости формирования их негативных колоний.

Для первого цикла исследований отбирали фаги 8573, 8573/гр, 8573/5 - чувствительная культура Pdmn fln 8573, они образовывали прозрачные бляшки диаметром от 1 до 3 мм; фаги 7325\1 - чувствительная культура Х. xndi v.

bi 7325 образовывали прозрачные бляшки диаметром от 0,1 до 0,5 мм (рис. 1).

Фаги 9034/1, 9034/4, 9034/5, 9034/8 - чувствительная культура Pnibi mx 9034 - образовывали прозрачные бляшки диаметром от 1 до 7 мм (рис. 2).

Рис. 1. - Морфология негативных колоний группы фагов: 1 – 7325 чувствительная культура - Х. xndi v. bi 7325; 2 - 8573 чувствительная культура - Pdmn fln Рис. 2 - Морфология негативных колоний группы фагов 9034 - чувствительная культура - Pnibi mx Сравнение морфологии негативных колоний исследуемых фагов показывает их различие. Более детальное изучение их свойств является важным для анализа распространения фагов в агроценозах, изучение их спектра литической активности.

При изучении репродукции вирусов бактерий в экосистемах важным свойством является спектр их литической активности, определение которого позволяет учитывать возможные пути переноса генетической информации в природе.

По спектру литической активности фаги были проверены на 20 штаммах бактерий, которые относились к четырем семействам Pdmn, Bi, Xnmn и Ewiniа.

В пределах определенного штамма бактерий по спектру литической активности бактериофаги 9034\2, 9034\3, 9034\4, 8573\1, 7325\1 были узкоспецифические и не лизировали другие штаммы фитопатогенных бактерий, кроме к тем, к которым они были и выделены, то есть они являются моновалентными.

Широкий спектр литической активности имели фаги 9034\1, 8573\2, 8573\3. Они лизировали фитопатогенные бактерии родов Pdmn, Xnmn, относящихся к разным видам. Изоляты фагов оказались поливалентными.

Среди исследуемых изолятов фагов три проявляли литическую активность по отношению к культурам, которые являются довольно широко распространенным в природе патогенами картофеля, возможно в процессе эволюции вирусы приспособились к репродукции на различных чувствительных культурах.

Среди изолятов выявлено группу фагов, с икосаэдрической головкой и длинным хвостовым отростком, который несокращается, и относятся к семейству iviid, порядка Cdvi, с размерами: диаметр головки - 7 ± 2 нм, длина хвостового отростка - 120 ± нм.

Биология фагов Рис. 3 - Електрономикроскопическое изображение фагов: а) 7325 №1; б) 9034; в) Другая группа фагов с икосаэдрической головкой и маленьким отростком, которые относятся к семейству Pdviid, порядка Cdvi и имели размеры: диаметр головки - ± 1 нм, длина хвостового отростка - 1нм [2]. Фотографии представлены на рис. 3.

Исследования, посвященные предупреждению развития бактериозов еще требуют дальнейшего развития, однако показана перспективность проведения биологического контроля численности бактерий с помощью фагов на практике.

1. Семчук Л.И. Токарчук Л.В. Распространение и специфичность бактериофагов фитопатогенных бактерий в природних биоценозах // Микробиологический журнал. –1994. –№5.

–c.102.

2. ckermnn H.-W., lendr nd S.T. edon (eds.). lssifiction of cteriophges. T Big, 2nd edn. Oxford: Oxford University ress. - 200. – p. 8–1.

CHARACTERIZATION ISOLATED PHAGES OF PHYTOPATHOGENIC

BACTERIA ISOLATED FROM POTATO

Key words: big, gni bi, i ivi, PFU.

Pg f gni Х. xndi v. bi 7325, Pdmn fln 8573, Pnibi mx 9034 w did v i infln n gni bi. d mg f ngiv ni. T ng f i i ivi 20 bi in w dmind. Ding i mgi ii g w fd xnmi g.

УДК 578.52.

ДЕТЕКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУЛЕНТНОСТИ

В ГЕНОМАХ БАКТЕРИОФАГОВ

Баннов В.А.*, тел. 8(4967) 36-00-79, bannov@online.stack.net;

Фурсова Н.К. *, кандидат биологических наук, тел. 8(4967) 31-19-11, fursova@obolensk.org;

Воложанцев Н.В.*, кандидат биологических наук, тел. 7-4967-36-01-47; nikvol@obolensk.org Коровкин С.А.**, доктор медицинских наук, профессор, тел. 8(495) 917–41–49, korovkin09@mail.ru;

Светоч Э.А. *, доктор ветеринарных наук, профессор, тел. 8(4967) 36-00-79, svetoch@obolensk.org *ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии»

**Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток Ключевые слова: бактериофаги, горизонтальный перенос генов, гены вирулентности Представлены данные литературы о роли бактериофагов в горизонтальном и вертикальном переносе генетических детерминант вирулентности у патогенных бактерий и результаты собственных исследований по выявлению генов токсинов в геномах бактериофагов.

Введение. Бактериофаги, в качестве мобильных генетических элементов (МГЭ), играют чрезвычайную роль в эволюции бактерий. Профаги зачастую содержат генетические детерминанты факторов вирулентоности, например: пирогенные и апирогенные токсические суперантигены стрептококков группы А [1]; фитнес-факторы mn ni серовара Typhimurium; остров патогенности Vibi ; шига-токсин Eii i серотипа O157:7; бактериоцины Pdmn gin; нейротоксин Cidim binm; фитнесфакторы gn, дифтерийный токсин Cnbim dii и др. [2].

Наличие в геноме большого количества профагов привносит в бактериальную клетку ряд эволюционных преимуществ: (i) повышенную генетическую мобильность и большую степень представленности факторов вирулентности в популяции бактерий; (ii) эпистатическое взаимодействие между генами вирулентности и генами бактериофага; (iii) амплификацию генов вирулентности в экосистеме за счет их переноса в бактерии-комменсалы, находящиеся в одном сайте инфекции с патогеном; (iv) повышение дарвиновского фитнеса бактерий в результате проявления свойств, модифицирующих экосистему [3]. Таким образом, взаимодействие между умеренными фагами и бактериями-хозяевами характеризуется как симбиотическая ассоциация [4].

Показано, что профаги встречаются в геномах бактерий не равномерно, а локализуются в «горячих точках», в соответствии со статистически достоверно установленной адаптацией к хромосомному генетическому окружению [5]. Именно встраивание профагов, несущих гены вирулентности, является основным механизмом конверсии свободноживущих бактерий в патогены у представителей разных таксонов: Gmmbi (Eii и Pdmn), Bbi (Bkdi) и Fimi (Bi) [].

Ярким примером ключевой роли бактериофагов в горизонтальном переносе генов и Биология фагов возникновении новых штаммов является эволюция E. i. Геномный анализ показал, что в ДНК эпидемического штамма E. i O157 ki присутствует множество мобильных генетических элементов (98 копий I-элементов), большое число генов, кодирующих факторы вирулентности (энтерогемолизин, Esp протеазу и большой клостридиально-подобный токсин), профагов или следов профагов, шесть больших хромосомных сегментов, которые представляют собой профаго-подобные генетические элементы [7]. Кроме того, бактериофаги играют очень важную роль в контроле бактериальной плотности природных популяций, на основе постоянно протекающей коэволюции фагов и бактерий-хозяев. Например, фаги играют ключевую роль в остановке эпидемий холеры [8].

В последние годы все более реальной становится возможная перспектива использования бактериофагов в качестве средств контроля инфекционных заболеваний. Предполагается, что фаговая терапия будет основана на использовании безопасных (только литических), хорошо охарактеризованных (на геномном и протеомном уровнях) и наработанных в соответствии с требованиями производства конвенциональных медицинских продуктов [9].

Целью данной работы является детекция генов вирулентности в препаратах ДНК литических бактериофагов.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследований явились 24 препарата ДНК литических бактериофагов, специфичных к mn Enteritidis (n = 3), mnholeresuis (n = 3), mn Infntis (n = 3), ig spp. (n = 2), Yini dbi (n = 2), Eii i (n = 11), в том числе серотипов O157:H7 (n = 4) и O104:H4 (n = 7).

C целью удаления бактериальной ДНК фаголизаты, полученные при размножении бактериофагов на культуре чувствительных бактерий, подвергали обработке ДНКазой и РНКазой в течение 2 ч при температуре 37 °С. Затем в фаголизат вносили хлористый натрий до концентрации 1 М и выдерживали в течение 2 ч на ледяной бане, центрифугировали, отбрасывали осадок, а к супернатанту добавляли ПЭГ 8000 до концентрации 10 % и инкубировали еще 2 ч на ледяной бане. После повторного центрифугирования осадок растворяли в 1 мл M буфера, обрабатывали протеиназой К в присутствии 0,5 % ДСН с последующей экстракцией фенолом в буфере TE (p 8,0). Водную фазу переосаждали изопропиловым спиртом. Дальнейшую отмывку проводили этиловым спиртом. Подсушенный осадок ресуспендировали в 0,3 мл буфера ТЕ. Количество и качество выделенной ДНК контролировали электрофоретически в 0,8 % агарозном геле и спектрофотометрически при длине волны 20 нм. Кроме того, подтверждали отсутствие генетического материала бактерий-хозяев с помощью мультипраймерных ПЦР тест-систем TЭK-104 и ТЭК-157 (Оболенск, Россия), КОЛИПОЛ (Литех, Россия), АмплиСенс lmonell spp.-Eh (Интерлабсервис, Россия), АмплиСенс Эшерихиозы–FL (Интерлабсервис, Россия), АмплиСенс EE-FL (Интерлабсервис, Россия).

Детекцию генов вирулентности проводили с помощью полимеразной цепной реакции в классическом режиме на термоциклерах T 100 (MJ Reserch, США) и Genemp (pplied Biosystems, США), а также в формате реального времени на приборе FX9 (BioRd, США). Для проведения реакции использовали 10 сульфатный буфер для ПЦР (50 mM Trisl (p = 8,9), 10 mM (4)2O4, 15 mM Mgl2, 0,5 % Tween 20). Реакционная смесь содержала 200 µM ДНТП, 0,25-0,5 µM праймеров и 1 ед. активности Tq-полимеразы. Режим проведения ПЦР: начальная денатурация при 95 °С -5 мин; затем 30-35 циклов, включающих в себя денатурацию при 95 °С -1 мин, отжиг праймеров при 50-0 °С – 1 мин и элонгацию при 72 °С – 1 мин; затем завершающая элонгация при 72 °С - 5 мин. Температура отжига праймеров определялась характеристикой используемых праймеров (таблица 1).

Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле в Трис-боратном буфере. Визуализацию ДНК проводили после окрашивания агарозных гелей в течение 20 мин в растворе (1 мг/л) бромистого этидия. Для документирования полученных результатов использовали систему DORIT (Viler Lourmt, Франция).

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты ПЦР-детекции показали, что во всех 24 исследованных образцах ДНК литических бактериофагов, специфичных к. Enteritidis,. holeresuis,. Infntis, ig spp., Y. dbi и E. i, отсутствуют гены, детерминирующие синтез шига-подобных токсинов tx1 и tx2, термолабильного энtx1 tx2, теротоксина LT, термостабильных энтеротоксинов ST и Еst, а также гены гемолизина Hly.

Полученные данные позволяют считать соответствующие литические бактериофаги достаточно безопасными с точки зрения возможной передачи генов токсинов при их использовании в качестве средств контроля плотности бактериальных популяций энтеробактерий у сельскохозяйственных животных и в окружающей среде.

Заключение. Проведенные молекулярно-генетические исследования показали отсутствие генов, детерминирующих синтез шига-подобных токсинов I- и II-типов, термолабильтипов, ного энтеротоксина, термостабильных энтеротоксинов St и Еst, а также гемолизина (Hly) в геномах 24 литических бактериофагов, специфичных к. Enteritidis,. holeresuis,. Infntis, ig spp., Y. dbi и E. i.

Таблица 1 – Праймеры, использованные для детекции генов бактерий Праймер Олигонуклеотидная последова- Tm, Ген- Примечание

TTTGTGGG

TTTGGGGTGG

Биология фагов 1. Bnks D.J., Beres.B., Musser J.M. The fundmentl contriution of phges to G evolution, genome diversifiction nd strin emergence. // Trends Microiol. – 2002. - Vol. 10. – o.

11. – P. 515-521.

2. Brssow., nchy., rdt W.D. hges nd the evolution of cteril pthogens:

from genomic rerrngements to lysogenic conversion. // Microiol. Mol. Biol. Rev. – 2004. – Vol.

8. – o. 3. –. 50-02.

3. edon.T., Lejeune J.T. Why cteriophge encode exotoxins nd other virulence fctors. // Evol. Bioinform. Online. – 2007. – Vol. 1. – P. 97-110.

4. Roossinck M.J. The good viruses: virl mutulistic symioses. // t. Rev. Microiol. – 2011. - Vol. 9. – o. 2. –. 99-108.

5. Boy L.M., Roch E.., Touchon M. The dpttion of Temperte Bcteriophges to Their ost Genomes. // Mol. Biol. Evol. – 2013. - Jn 15. [Epu hed of print]. Busy B., Kristensen D.M., Koonin E.V. ontriution of phge-derived genomic islnds to the virulence of fculttive cteril pthogens. // Environ. Microiol. – 2013. – Vol. 15. – o. 2.

P. 307-312.

7. Ohnishi M., Kurokw K., yshi T. Diversifiction of Eii i genomes: re cteriophges the mjor contriutors? // Trends Microiol. – 2001. – Vol. 9. – o. 10. –. 481-485.

8. Fruque.M., ser I.B., Islm M.J. et l. esonl epidemics of choler inversely correlte with the prevlence of environmentl choler phges. // roc. tl. cd. ci. U – 2005. - Vol.

102. – o. 5. –. 1702–1707.

9. irny J.-., Vereken G., Rose T., Jennes., izi M., uys I., Lvigne R., Merishvili M., Vneechoutte M., Buckling., DeVos D. Introducing yesterdy’s phge therpy in tody’s medicine. // Future Virol. – 2012. – Vol. 7. – o. 4. –. 379–390.

DETECTION OF THE VIRULENCE DETERMINANTS

IN THE BACTERIOPHAGE GENOMES

Bannov V.A., Fursova N.K., Volozhantsev N.V., Korovkin S.A., Svetoch E.A.

f big in izn nd vi gn nf f vin dminn f mn gn.

УДК 619:

ПОИСК И СЕЛЕКЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PROVIDENCIA

Барт Н. Г., ассистент, тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart 1967@mail.ru Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: fvm.zol@yandex.ru Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, бактерии рода Pvidni, выделение, селекция, пассирование, методики, индукция.

В данной статье представлены результаты работы по выделению бактериофагов Pvidni, используя методики по выявлению профага и выделению фагов из обектов внешней среды. Профаги методом индукции не выделены. Из обектов внешней среды выделено фагов.

Актуальность исследования. Бактерии рода Pvidni ранее относились к одному из видов рода P семейства Enbi. Самостоятельное название род Pvidni он получил лишь в 193 году на основе Международной классификации Enbi. В 9-ом издании «Определителя бактерий Берджи» (1997) род Pvidni представлен 5 видами:

P.gifin, P.gi, P.ii, P.imb, P.iginii, отличающиеся друг от друга некоторыми биохимическими свойствами [2].

Бактерии рода Pvidni широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника, однако среди них встречаются и варианты, способные вызывать вспышки гастроэнтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей, желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [1, 3].

При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной которых являются представители рода Pvidni, существует ряд трудностей. Одна из них состоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их культуральные и биохимические свойства, сходные с бактериями рода P. Трудоемкость и материалоемкость делают бактериологический метод неэффективным в современных условиях. В связи с этим возникла необходимость в поиске ускоренного метода индикации и идентификации Pvidni с использованием специфических бактериофагов [4, 5]. Исходя из этого, цель наших исследований – выделение и селекция фагов Pvidni.

Материалы и методы. Индикаторными культурами при выделении изолятов фагов служили штаммы Pvidni. Исследование материала на присутствие фагов и изучение их биологических свойств проводили по методикам: М. Адамс [1], Д.М. Гольдфарба [2], С.Н. Золотухиным [4], И.П. Ревенко [5].

Результаты исследований. Выделение фагов бактерий рода Pvidni из исследуемого материала проводили, используя несколько методик. В первой серии опытов использовали методику выделения фагов из бактерий без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на культуры Pvidni, исследуемые как «лизогенные», мы воздействовали индуцирующим фактором. Использовалась методика Гольдфарба (192). На подсушенный газон 18-ти часовой культуры воздействовали ультрафиолетовыми лучами в течение 5- минут (интервал составил 2 минуты) при помощи бактерицидной лампы, 80 % энергии которой приходится на длину волны 2537, на расстоянии 50 см между лампой и объектом). Затем делали смыв культуры Pvidni стерильным физиологическим раствором, смыв фильтроваБиология фагов ли и полученный фильтрат исследовали на наличие фага на индикаторной культуре Pvidni методом агаровых слоев по Грациа. Поиск профага в исследуемых культурах Pvidni методом индукции не привел к положительным результатам.

Поэтому, третьим этапом наших исследований было использование методики по выявлению фагов из объектов внешней среды по Адамсу (191). Первоначально готовили смесь мясо-пептонного бульона с исследуемым объектом (почва, сточные воды, фекалии) в соотношении 10:1, добавляли индикаторные культуры и термостатировали посевы 2-3 суток при температуре 37 0С. Затем смесь очищали от механических примесей фильтрованием, центрифугировали при 3000 об./мин, прогревали при 0 0С в течение 30 минут и исследовали на наличие фага методом «стекающая капля».

На поверхность 1,5 % мясо-пептонного агара в чашках Петри наносили пипеткой 3– капли 18–ти часовой бульонной культуры Pvidni, которую стерильным шпателем растирали по поверхности среды. Чашки ставили в термостат при 37 0С для подсушивания газона на 20-30 минут. Чашку делили на два сектора при помощи маркера. На поверхность засеянной среды наносили исследуемый на наличие бактериофага субстрат и наклоняли чашку Петри так, чтобы капля стекла, на вторую половину таким же образом наносили мясо-пептонный бульон (для контроля). Посевы ставили в термостат (температура 37 0С), учет результатов проводили через 18 часов. Наличие зон лизиса на газоне роста свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага Pvidni.

Выделение чистых линий фага и их селекцию проводили путем последовательных десяти пассажей морфологически однотипных негативных колоний на плотных питательных средах на индикаторной культуре Pvidni в соответствии с методикой, описанной и использованной Золотухиным [5].

В результате проведенных исследований по выявлению специфичных бактериофагов рода Pvidni, было установлено, что имеющиеся у нас 28 штаммов культур рода Pvidni не проявляли лизогенных свойств. Феномен профага выявлен не был. Используя методику выделения фагов из объектов внешней среды, нами было выделено 1 специфичных для рода Pvidni фагов, являющихся заведомо вирулентными. «Чистые линии» выделенных фагов Pvidni мы десятикратно пассировали на индикаторных культурах, что значительно повышало титр их литической активности.

1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) М., 191. С. 521.

2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 191. С.297.

3. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных.

Ульяновск, 2004. С. 125.

4. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. Ульяновск, 2005. С.48-51.

5. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев:

«Урожай», 1978. С.20-21.

SEARCH AND SELECTION OF BACTERIOPHAGES PROVIDENCIA

Bart N.G., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.

Кey words: big, bi f gn Pvidni, in, in, ging, md, indin.

ing md f idnifiin f g nd in f g fm bj f nvinmn. T g wn’ igigd b md f indin. 16 g w d fm nvinmn bj.

УДК 619:

ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ РОДА PROVIDENCIA

Барт Н. Г., ассистент, тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart 1967@mail.ru Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: fvm.zol@yandex.ru Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, Pvidni, литическая активность, терморезистентность, специфичность.

В данной статье представлены результаты работы по выделению и изучению некоторых биологических свойств бактериофагов Pvidni. В результате исследований были изучены: литическая активность, терморезистентность и специфичность.

Бактерии рода Pvidni широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи животных и человека [4].

Некоторые штаммы, вероятно, входят в состав нормальной микрофлоры кишечника, однако среди них встречаются и патогенные варианты, способные вызывать вспышки гастроэнтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей, раневые послеоперационных инфекций, желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [5].

Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременности диагностики болезни, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых указанными микроорганизмами, является актуальной проблемой.

При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной которых являются представители рода rovidenci, существует ряд трудностей. Одна из них состоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их биохимические свойства.

Трудоемкость и длительность изучения ферментативных свойств не позволяют быстро и точно идентифицировать названные микроорганизмы.

В связи с этим возникла необходимость в поиске альтернативных методов лабораторной диагностики, которые были бы менее трудоемкими, более быстрыми и доступными для лабораторий любого уровня. Одним из таких методов является фагодиагностика [1- 3, 5-8].

Поэтому целью наших исследований явилось изыскание активных бактериофагов, лизирующих патогенные штаммы бактерий рода rovidenci.

Материал и методы исследования.

Источником для выделения бактериофагов служили сточные воды взятые из животноводческих помещений разных хозяйств Ульяновской и Самарской областей и больниц города Ульяновска.

В качестве индикаторных культур были использованы 2 патогенных штаммов рода rovidenci, полученные из музея кафедры и выделенные нами из патологического материала и объектов внешней среды.

В основу метода для поиска фагов положена схема, предложенная Грациа [1-3]. ИсБиология фагов следуемый материал (сточные воды) засевали с бактериями rovidenci на МПБ. Бульон инкубировали при 37°С в течение 14-18 часов, затем фильтровали через бумажные фильтры. Полученный фильтрат подогревали при 0°С в течение 30 минут для инактивации сопутствующей микрофлоры. Наличие фага в фильтрате выявляли при его посеве на плотные питательные среды (1,5% мясопептонный агар) методом агаровых слоев.

Селекцию штаммов фагов производили методом пассирования штаммов на индикаторных культурах с последующим клонированием однородных негативных колоний, типичной для каждого изолята.

Активность выделенных фагов определяли по методам Грациа и Аппельмана [1- 3].

Результаты и выводы исследования В результате проведенных исследований нами было выделено 1 термостабильных изолята бактериофагов, образующих прозрачные колонии различного диаметра от 1,0 до 5, мм (рис.1) или стерильные пятна в виде зон лизиса, диаметром от 5,0 до 9,0 мм (рис.2). Литическая активность выделенных фагов по методу Аппельмана составляет от 10- до 10-9, по методу Грациа – от 2,1х108 до 1,2х1011 фаговых корпускул в 1 мл среды.

Рис.1- Негативные колонии бактериофагов рода Pvidni (штамм фага F-67 УГСХА) Рис.2 - Негативные колонии бактериофагов рода Pvidni (штамм фага F-87 УГСХА) Изучение специфичности двух бактериофагов (F-7 УГСХА, F-87 УГСХА), имеющих высокую активность и широкий диапазон литического действия проводили по отношению к представителям других родов семейства Enteroctericee: Escherichi spp., roteus spp., Morgnell spp., itrocter spp., lmonell spp., Enterocter spp., Yersini enterocolitic, а также родов других семейств: tphylococcus spp., treptococcus spp., seudomons spp. на плотном питательном агаре методом нанесения капель фагов на газон исследуемой культуры [1- 3].

Для этого на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3 – 4 капли 18 часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на – 20 минут. После чего, дно чашки маркером разделили на два сектора: на первый сектор засеянного агара, пипеткой легким прикосновением капли, наносили исследуемый фаг; на второй - по центру в качестве контроля наносили стерильный МПБ. Чашку наклоняли, чтобы капли стекли, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили через 24 часа.

В результате проведенных исследований было установлено, что селекционированные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств, тоесть явились специфичными для бактерий гомологичного рода.

Таким образом, нами было выделено и селекционировано 1 термостабильных изолятов фагов, активных в отношении бактерий вида rovidenci rettgeri (табл.1).

Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов рода Pvidni Название фага Индикаторная культура Были отобраны два специфичных штамма фагов с наиболее выраженными биологическими свойствами, которые позволяют использовать их для изготовления диагностических биопрепаратов.

1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) // - М., - 191. -521С.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии // Учебное пособие – Ульяновск. – 1988. – С.45.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// -М.: Медгиз. -191. – С.297.

4. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. с., Ульяновск., -2004.

5. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят Биология фагов и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. – Ульяновск. – 2005. – С.48-51.

. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:

«Урожай», 1978. –С.20-21.

CHARACTERISTICS OF BACTERIOPHAGES OF GENUS PROVIDENCIA

Bart N.G., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.

Кey words: big, Pvidni, i ivi, min, ifii.

i f big Pvidni. A f w did: i ivi, min nd ifii.

УДК 578.81:579.

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ

БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Васильева Ю.Б., кандидат ветеринарных наук, доцент 8(8422) 55-95-47, vet_yulua@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Семанина Е.Н., научный сотрудник НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Bd bnii, выделение фагов, свойства бактериофагов В статье освещён вопрос по разработке методов выделения бактериофагов, активных в отношении Bd bnii. Приведены результаты собственных научных исследований биологических свойств выделенных бактериофагов: морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа и изменение литической активности при хранении.

Введение. В настоящее время отечественные и зарубежные исследователи особое внимание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний животных и людей, характеризующихся затяжным течением, а нередко и летальным исходом. К таким инфекциям относится бордетеллёз - коклюшеподобное заболевание собак, кошек и других домашних и сельскохозяйственных животных, возбудитель которого, Bd bnii, может вызывать и у людей респираторные заболевания по типу ОРВИ [2,8,10].

Учёными НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи охарактеризованы бактериофаги микроорганизмов рода Bd, выделенные из бактерий коллекции ВОЗ и клинических штаммов, бактериофаги B-1, BM-1 и BI-1 B.bnii. Эти данные использованы для разработки тест-систем для идентификации ДНК возбудителя коклюша и его фазовых вариантов с помощью полимеразной цепной реакции. Метод рекомендуется для диагностики коклюша у детей с симптомами затяжного кашля, а также выявления атипичных, бессимптомных форм заболеБиология фагов вания [9].

Научно-исследовательской группой НИИМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им.

П.А. Столыпина разработаны полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза животных и бактериологическая схема выделения B.bnii с применением селективно – диагностической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поставить диагноз в течение 9 часов [2,3].

Эти современные и эффективные методы диагностики также имеют и ряд недостатков в практическом применении. Для проведения генетической диагностики необходимо наличие специализированной лаборатории с дорогостоящей приборной базой и высококвалифицированными работниками. Микробиологические методы диагностики бордетеллёза достаточно трудоёмки (выделение культуры возбудителя на селективных средах, биохимическая идентификация и т.п.), дорогостоящи и малопроизводительны.

Поэтому остро встает задача создания высокочувствительных и специфичных средств и методов диагностики бордетеллёза не требующих больших затрат времени и труда, а также экономически выгодных.

Мы считаем, что заслуживает пристального изучения разработка методов выделения бактериофагов B. bnii с перспективой создания биопрепарата для диагностики бордетеллеза животных. Данное научное направление, по нашему мнению, весьма актуально, представляет научный и практический интерес.

В связи с вышесказанным целью данной научной работы явилась разработка методов выделения фагов B. Bnii с изучением их основных биологических свойств.

Для решения поставленной цели перед нами стояли следующие задачи:

1. Апробировать различные схемы выделения бактериофагов, активных в отношении B. Bnii и подобрать наиболее эффективный метод.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфологию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу.

3. Провести селекцию выделенных фагов и подобрать оптимальный набор для дальнейшего конструирования на их основе нового диагностического биопрепарата.

Материалы и методы исследований. Объектами для наших исследований послужили 5 референс-штаммов B. bnii № 1, № 7, № 214, № 2207, № 8344 и штамм Bdi № 119; 24 референс-штамма бактерий других родов (Yini dbi № 0630, Mgn mgnii, № АТСС 25923, Eii i № 4, № АТСС 25922, P mibii № 1, № 523, № 491, mn imim № 82, Cibfndii, Kbi nmni, En fi № 189, Pvidni gi № 104а, № 102д, № 175, Amn di № 01, № 02, Pdmn id № 12633, № 901, EnbBi № 2527, Bi bii № 6633), полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им. П.А. Столыпина, которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; 48 штаммов B. bnii, выделенных от собак и кошек (с клиническими проявлениями респираторных заболеваний); 8 штаммов фагов B. bnii.

Обекты внешней среды: сточные воды, смывы с глотки больных животных, патологический материал от больных и павших животных.

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среда Эндо, казеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар и среда Борде-Жангу, среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом, биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, агар-агар, натрий хлорид, мочевина, перекись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.

Биология фагов В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и идентификации бактерий [4].

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили с помощью методов, предложенных М. Адамсом (191), Д.М. Гольдфарбом (191), И.М. Габриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (200) [1,4,5,,7]. Постановку РНФ для индикации B.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«Институт систематики и экологии животных СО РАН Териологическое общество при РАН Новосибирское отделение паразитологического общества при РАН ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ТЕРИОЛОГИИ 18–22 сентября 2012 г., Новосибирск Тезисы докладов Новосибирск 2012 УДК 599 ББК 28.6 А43 Конференция организована при поддержке руководства ИСиЭЖ СО РАН и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 12-04-06078-г) Редакционная коллегия: д.б.н. Ю.Н. Литвинов...»

«алтайский государственный университет Ботанический институт им. в.л. комарова ран Центральный сиБирский Ботанический сад со ран алтайское отделение русского Ботанического оБЩества Проблемы ботаники Южной сибири и монголии Сборник научных статей по материалам Деcятой международной научно-практической конференции (Барнаул, 24–27 октября 2011 г.) Барнаул – 2011 уДК 58 П 78 Проблемы ботаники Южной сибири и монголии: сборник научных статей по материалам X международной научно-практической...»

«АССОЦИАЦИЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ПО КЛЕТОЧНЫМ КУЛЬТУРАМ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ISSN 2077- 6055 КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ ВЫПУСК 27 CАНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2011 ISSN 2077- 6055 УДК 576.3, 576.4, 576.5, 576.8.097, М-54 Клеточные культуры. Информационный бюллетень. Выпуск 27. Отв. ред. М.С. Богданова. - СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2011. - 94 с. Настоящий выпуск содержит информацию об основных направлениях фундаментальных и прикладных исследований на клеточных культурах, о...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/11/22* 10 September 2012 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Одиннадцатое совещание Хайдарабад, Индия, 8-19 октября 2012 года Пункт 10.1 предварительной повестки дня** МОРСКОЕ И ПРИБРЕЖНОЕ БИОРАЗНООБРАЗИЕ: ДОКЛАД О ХОДЕ РАБОТЫ ПО ОПИСАНИЮ РАЙОНОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ КРИТЕРИЯМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ИЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ МОРСКИХ РАЙОНОВ Записка Исполнительного секретаря ВВЕДЕНИЕ I. На своем десятом совещании...»

«В защиту наук и Бюллетень № 8 67 Королва Н.Е. Ботаническую науку – под патронаж РПЦ? (по поводу статьи члена-корреспондента РАН, д.б.н. В.К. Жирова Человек и биологическое разнообразие: православный взгляд на проблему взаимоотношений)119 1. Проблема Проблемы взаимодействия власти и религии, науки и религии, образования и религии требуют современного переосмысления и анализа. Возможен ли синтез научного и религиозного знания, и не вредит ли он науке и научной деятельности, и собственно,...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/14 РАЗНООБРАЗИИ 15 January 2006 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20-31 марта 2006 года Пункт 19 предварительной повестки дня* ГЛОБАЛЬНАЯ ИНИЦИАТИВА ПО УСТАНОВЛЕНИЮ СВЯЗИ, ПРОСВЕЩЕНИЮ И ПОВЫШЕНИЮ ОСВЕДОМЛЕННОСТИ ОБЩЕСТВЕННОСТИ Обзор осуществления программы работы и вариантов по продвижению дальнейшей работы Записка Исполнительного секретаря ВВЕДЕНИЕ...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/12/10 23 July 2014 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Двенадцатое совещание Пхёнчхан, Республика Корея, 6-17 октября 2014 года Пункт 12 предварительной повестки дня* ОБНОВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРЕСМОТРА/ОБНОВЛЕНИЯ И ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТРАТЕГИЙ И ПЛАНОВ ДЕЙСТВИЙ ПО СОХРАНЕНИЮ БИОРАЗНООБРАЗИЯ, ВКЛЮЧАЯ НАЦИОНАЛЬНЫЕ ЦЕЛЕВЫЕ ЗАДАЧИ, И ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ПЯТЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ ДОКЛАДОВ Записка Исполнительного секретаря**...»

«UNEP/CBD/COP/7/21 Страница 112 Приложение РЕШЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ СЕДЬМЫМ СОВЕЩАНИЕМ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Решение Страница VII/1. Биологическое разнообразие лесов 114 VII/2. Биологическое разнообразие засушливых и субгумидных земель VII/3. Биологическое разнообразие сельского хозяйства 114 VII/4. Биологическое разнообразие внутренних водных экосистем 114 VII/5. Морское и прибрежное биологическое разнообразие 160 VII/6. Процессы проведения оценок 114 VII/7. Оценка...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/10/18 23 August 2010 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Десятое совещание Нагоя, Япония, 18-29 октября 2010 года Пункт 4.9 повестки дня ПРИВЛЕЧЕНИЕ К РАБОТЕ СУБЪЕКТОВ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И ОСНОВНЫХ ГРУПП И УЧЕТ ГЕНДЕРНОЙ ПРОБЛЕМАТИКИ Записка Исполнительного секретаря ВВЕДЕНИЕ I. Эффективное осуществление Конвенции зависит от участия и привлечения к работе 1. субъектов деятельности и коренных и местных общин. Об этом...»

«Международная экологическая ассоциация хранителей реки Eco-TIRAS Образовательный фонд имени Л.С.Берга Eco-TIRAS International Environmental Association of River Keepers Leo Berg Educational Foundation Академику Л.С. Бергу – 135 лет: Сборник научных статей Academician Leo Berg – 135: Collection of Scientific Articles Eco-TIRAS Бендеры - 2011 Bendery - 2011 CZU[91+57]:929=161.1=111 A 38 Descrierea CIP a Camerei Naionale a Crii Academician Leo Berg – 135 years: Collection of Scientific Articles =...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О UNEP/CBD/COP/6/3 БИОЛОГИЧЕСКОМ 27 March 2001 РАЗНООБРАЗИИ RUSSIAN Original: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Шестое совещание Гаага, 8-19 апреля 2002 года Пункт 9 предварительной повестки дня* ДОКЛАД ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ОРГАНА ПО НАУЧНЫМ, ТЕХНИЧЕСКИМ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ КОНСУЛЬТАЦИЯМ О РАБОТЕ ЕГО ШЕСТОГО СОВЕЩАНИЯ СОДЕРЖАНИЕ Пункт Пункты Стр. повестки дня 1. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ 2. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ 3. ДОКЛАДЫ 4. ИНВАЗИВНЫЕ...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/2 РАЗНООБРАЗИИ 18 April 2005 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Бразилия, 20–31марта 2006 года ДОКЛАД О РАБОТЕ ДЕСЯТОГО СОВЕЩАНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ОРГАНА ПО НАУЧНЫМ, ТЕХНИЧЕСКИМ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ КОНСУЛЬТАЦИЯМ ОГЛАВЛЕНИЕ Страница ПУНКТ 1 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ ПУНКТ 2 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ A. Участники совещания B. Выборы должностных лиц C....»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/7/18 РАЗНООБРАЗИИ 10 November 2003 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Седьмое совещание Куала-Лумпур, 9-20 и 27 февраля 2004 года Пункт 20.1 предварительной повестки дня* ФИНАНСОВЫЕ РЕСУРСЫ И МЕХАНИЗМ ФИНАНСИРОВАНИЯ (СТАТЬИ 20 И 21) Дополнительные финансовые ресурсы Записка Исполнительного секретаря I. ВВЕДЕНИЕ 1. В преамбуле Конвенции о биологическом разнообразии признается, что...»

«ФОРМА ЗАЯВКИ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ МАТЕРИАЛОВ Министерство природных ресурсов и экологии на участие в конференции: Заявки и материалы, объемом до 5 страниц Российской Федерации (включая таблицы, рисунки и библиографический Фамилия Управление Федеральной службы список), принимаются в печатном и электронном по надзору в сфере природопользования виде до 12 мая 2014 г. по Кировской области Имя Федеральное государственное бюджетное Электронный вариант: стандартный формат Word учреждение Государственный...»

«НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Материалы VI-й Международной студенческой научной конференции, посвящённой 70-летию ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина 14 – 15 мая 2013 года Часть I Ульяновск – 2013 Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО...»

«Российская академия наук Институт озероведения РАН Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем II Bioindication in monitoring of freshwater ecosystems II Издательство Любавич Санкт-Петербург 2011 УДК 504.064.36 Ответственные редакторы: Член-корр. РАН В.А. Румянцев, д.б.н. И.С. Трифонова Редакционная коллегия: д.б.н. И.Н. Андроникова, к.б.н. В.П. Беляков, к.б.н. О.А. Павлова, к.б.н. М.А. Рычкова Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем II. Сборник материалов международной...»

«Уважаемые коллеги! Миркин Б.М., д.б.н., профессор, Башкирский Оргкомитет планирует опубликовать научные гос. университет материалы конференции к началу ее работы. Приглашаем Вас принять участие в работе П е н ч у ко в В. М., а к а д е м и к РАСХ Н, Для участия в работе конференции Международной научной конференции необходимо до 1 февраля 2010 года Ставропольский гос. аграрный университет Теоретические и прикладные проблемы П е т р о в а Л. Н., а к а д е м и к РА С Х Н, н ап р а в и т ь...»

«Международная научно-практическая конференция МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ 26 МАЯ 2014Г. Г. УФА, РФ ИНФОРМАЦИЯ О КОНФЕРЕНЦИИ ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ КОНФЕРЕНЦИИ Цель конференции: поиск решений по актуальным проблемам современной наук и и Клиническая медицина. 1. распространение научных теоретических и практических знаний среди ученых, преподавателей, Профилактическая медицина. 2. студентов, аспирантов, докторантов и заинтересованных лиц. Медико-биологические науки. 3. Форма...»

«УСТАВ РУССКОГО ЭНТОМОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА ПРИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (Принят Бюро Отделения общей биологии РАН 27 марта 1995 г.) 1. Общие положения 1.1. Русское энтомологическое общество при Российской академии наук, в дальнейшем именуемое РЭО, является некоммерческой организацией — научным обществом Отделения общей биологии при РАН — и осуществляет свою деятельность в соответствии с существующим законодательством и настоящим Уставом. 1.2. РЭО является юридическим лицом. Оно имеет свои...»

«Компании-участницы выставки в рамках XXIII международной конференции РАРЧ Репродуктивные технологии сегодня и завтра 4 – 7 сентября 2013, Волгоград ГЕНЕРАЛЬНЫЙ СПОНСОР КОНФЕРЕНЦИИ Merck Serono Мерк Сероно является фармацевтическим подразделением компании Мерк 125445, Москва, КГаА (г.Дармштадт, Германия). В 150 странах мира Мерк Сероно ул. Смольная, д.24Д поставляет на рынок препараты ведущих брендов, помогающие пациентам в борьбе с онкологическими заболеваниями, рассеянным склерозом, (495)...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.