WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия Всероссийский совет молодых учёных и специалистов аграрных ...»

-- [ Страница 3 ] --

Целью настоящей работы была разработка специфических праймеров к ДНК Ornithobacterium rhinotracheale, создание и апробация ПЦР-протокола.

Для анализа нуклеотидного состава ДНК Ornithobacterium rhinotracheale были использованы базы данных GeneBank и Afsa. Для поиска уникальных последовательностей специфического гена были использованы ресурсы GeneBank – on-line Blast.

Для подбора праймеров были использованы программы Gene Runner Version 3.05 и Primer Blast (ресурсы GeneBank).

термоциклер «ДТ-322» производства ООО «ДНК-Технология», г.Москва, Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии позволяющий проводить амплификацию и флуоресцентную детекцию в режиме «реального времени».

После синтеза олигонуклеотидов были подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции (концентрация праймеров, температурные параметры и количество циклов амплификации). Для проведения амплификации использована коммерческая стандартизированная реакционная смесь для проведения ПЦР в режиме «реального времени» с Taq-ДНК-полимеразой и ингибирующими ее активность антителами в присутствии красителя SYBR Green I производства «Компании «Синтол» (г.Москва). Для выделения ДНК применялись реактивы « Проба ГС» производства ООО «ДНК-Технология»(г.Москва). Для проведения электрофоретической детекции продуктов амплификации были использованы коммерческие наборы производства ООО «ДНК-Технология»

(г.Москва), содержащие готовые 2,3% агарозные гели с сухой навеской буферной смеси.

Для апробации предложенной методики были использованы полевые штаммы Ornithobacterium rhinotracheale НИИЦМБ Ульяновской УГСХА и культура Ornithobacterium rhinotracheale (штамм № 51463, 51464).

Для дизайна праймеров нами было решено использовать 16s рибосомальный ген Ornithobacterium rhinotracheale.

В базе данных GeneBank была найдена полная нуклеотидная последовательность гена 16sRNA. Затем она была просканирована системой Blast этой базы данных на предмет совпадения с существующими данными секвенирования других микроорганизмов. 100% совпадения более не встречалось, следовательно, оставалось выбрать только уникальные последовательности, фланкирующие участок гена 16sRNA Ornithobacterium rhinotracheale. После ряда проведенных анализов программами Gene Runner v.3.05 и Primer-Blast (в режиме online) эти последовательности были определены; они фланкировали участок гена размером 302 пары нуклеотидных оснований.

Праймеры (16S-1 размером 19 п.о. и 16S-2 размером 19 п.о.) были синтезированы в «Компании «Синтол» (г.Москва).

Для самой полимеразной цепной реакции было решено использовать коммерческий набор с оптимизированной буферной системой, Taq-ДНКполимеразой и ингибирующими ее активность антителами в присутствии красителя SYBR Green I производства «Компании «Синтол» (г.Москва), который содержал смесь: 125 мкМ dNTP, 1.25 u Taq-ДНК-полимеразу c ингибирующими ее активность антителами (для «горячего старта»), 1,25 мМ MgCl2, а также 10х ПЦР-буфер и минеральное масло. Объем реакционной смеси без матричной ДНК в конечном виде составлял 25 мкл. Объем пробы матричной ДНК, вносимой в реакционную смесь, составил 5 мкл.

Культуры Ornithobacterium rhinotracheale были подвергнуты этапу выделения ДНК с помощью коммерческого набора «Проба-ГС» производства ООО «ДНКТехнолгия» (г.Москва) с сорбентной технологией очистки.

Затем нами был проведен ряд экспериментов для оптимизации протокола ПЦР.

Для процесса амплификации был использован детектирующий термоциклер «ДТ-322» производства ООО «ДНК-Технология» (г.Москва) c возможностью флуоресцентой детекции во время амплификации (режим «реального времени»).

Флуоресценцию дает интеркалирующий краситель SYBR Green I, который связывается в процессе амплификации в двухцепочечной ДНК (2). Таким образом, чем больше ампликонов образуется в процессе реакции, тем сильнее сигнал флуоресценции, а это, в свою очередь, можно применить для количественной оценки исходной матричной ДНК Ornithobacterium rhinotracheale. Единственный Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии недостаток применения интеркалирующего красителя заключается в том, что флуоресцирует не только специфический ампликон, но и связавшийся с неспецифическими продуктами SYBR Green I (3). Поэтому для точной оценки полученных продуктов амплификации мы применяли также метод горизонтально электрофоретической детекции в 2,3% агарозном геле.

13.03. Настройки анализа: метод: Геометрический (Cp) (BF), lf=12, ne=7, cr=9, vt=10, nf=20, calibr=1, tp=0, tv= Рис 1. ПЦР-протокол детекции участка гена 16sRNA Ornithobacterium rhinotracheale в присутствии красителя SYBR Green I в режиме «реального времени».

Одновременный экспериментальный ряд содержал несколько реакционных пробирок, у которых температура отжига праймеров снижалась с 75С до 60 с шагом в 5С. Сам протокол проведения амплификации состоял из трех этапов:

денатурации ДНК при 95С, отжига праймеров на денатурированной ДНК, элонгации (синтеза новой цепи с помощью фермента Taq-ДНК-полимеразы, наибольшая активность которой проявляется при 72С). Нами был выбран классический тип Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии протокола ПЦР без предварительных «посадочных» циклов. Однако для активации Taq-ДНК-полимеразы требовалась инактивация антител, ингибирующих ее действие. После ряда проведенных опытов нами было установлено, что оптимальной температурой отжига праймеров оказалась температура 60С. При этой температуре наблюдался максимальный продукт амплификации.



Таким образом, в конечном варианте он имел следующий вид:

3. 72С – 2 мин - 1 цикл Аналогично опытам по оптимизации температурного режима были проведены эксперименты по оптимизации конечной концентрации праймеров в реакционной смеси. Нами было установлено, что избыток праймеров в реакции приводил к образованию неспецифических продуктов амплификации, имеющих размер продукта, не превышающего 100 п.о. Недостаток праймеров в экспериментальном ряде приводил либо к образованию продуктов амплификации слишком большой длины (>1000-2000 п.о.), либо видимой детекции не наблюдалось вовсе. Таким образом, была выявлена оптимальная концентрации праймеров в реакционной смеси – по 15 pmol 16S-1 и 16S-2.

Рис.2 Электрофорез тех же продуктов амплификации в 2,3% агарозном геле (с конечной концентрацией праймеров по 15 pmol на реакционную смесь): ДНК Ornithobacterium rhinotracheale 1штамм №51463, 2-штамм №51464, 3-штамм №51464/6.11, 4-штамм №18.11, 5-штамм №Or-20; 6отрицательный контроль; 7-маркер молекулярного веса M-100.

Из-за отсутствия количественных стандартов ДНК Ornithobacterium rhinotracheale нами были определены их относительные концентрации в предложенных пробах. В качестве единицы было предложено принять пробу с Срmax. Таким образом, мы получили величины концентраций ДНК относительно их минимального количества в эксперименте (см. табл.).

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Определение относительной концентрации ДНК Ornithobacterium rhinotracheale D7 КВ результате проведенной нами работы были определены специфичные праймеры, фланкирующие часть гена 16sRNA генома Ornithobacterium rhinotracheale.

Фланкируемый участок гена 16sRNA имеет длину 302 пары нуклеотидов.

Были подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции с выбранной парой праймеров в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I. Детекция флуоресценции во время реакции позволила оценить относительное количество исходной матричной ДНК.

Метод применения интеркаляторов при проведении ПЦР в режиме «реального времени» является не столь специфичным, как применение флуоресцентных зондов, но позволяет существенно снизить материальные затраты при проведении количественного исследования. Скомпенсировать этот недостаток мы смогли горизонтального электрофореза в агарозном геле.

1. Красноженов Е.П. и др. Микробиологическая диагностика инфекционных заболеваний // Ростов н/Д: Феникс, 2006.

2. Ребриков Д.В., Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, А.М. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов. ПЦР в реальном времени. М: Бином.

Лаборатория знаний, 2009.

3. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of DNA sequences. Biotechnology, 1992, 10:413-417.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619:578.832.

РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОЙ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ BORDETELLA

BRONCHISEPTICA

WORKING OUT OF THE OPTIMUM SCHEME OF ALLOCATION BORDETELLA

BRONCHISEPTICA

Д.Г. Сверкалова, Л.Ю. Ракова, Л.А. Укстина, Ю.Б. Васильева D.G. Sverkalova, L.J. Rakova, L.A. Ukstina, Yu.B. Vasileva Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology Research is devoted working out of the optimum scheme of indication and identification Bordetella bronchiseptica. It is the activator, which vyzy-vaet serious disease of respiratory ways at pets.

Все чаще в западной литературе стали обращать внимание на заболевание, развивающееся у домашних животных – бордетеллез.

Бордетеллез – инфекционное заболевание, вызываемое мелкой (0,2-0,3*0,5мкм) грамотрицательной коккобациллой Bordetella bronchiseptica и характеризующееся развитием острого или хронического воспалительного процесса слизистой оболочки респираторного тракта, сухим кашлем, который часто принимает пароксизмальный характер, снижением общей активности организма, а в совокупности осложнений другими бактериальными или вирусными инфекциями – развитием тяжелых симптомов, характерных для пневмонии.

Бордетеллезная инфекция широко распространена среди собак и кошек в Западной Европе, Нидерландах, Великобритании, США.

Несмотря на неприхотливость роста на простых и селективных средах, остаются некоторые сложности культивирования Bordetella bronchiseptica.

В настоящее время диагноз на бордетеллезную инфекцию животных устанавливают на основании комплексных клинико-эпизоотологических, бактериологческих и серологических исследований.

Для лабораторной диагностики бордетеллёза возможно использование следующих методов:

микробиологические (культуральные, морфологические, тинкториальные иммунологические методы;

молекулярно-генетические (полимеразная-цепная реакция);

Целью нашего исследования была разработка оптимальной схемы выделения Bordetella bronchiseptica.

Работа проводилась в научно-исследовательском инновационном центре микробиологии и биотехнологии кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ.

В работе были использованы штаммы Bordetella bronchiseptica: 22-067, 214, 7, 1, 2 из коллекции музея кафедры центра.





Для первичного выделения культур Bordetella bronchiseptica использовали среду бордетелагар с 0,003% цефазолона, среду для первичного выделения Bordetella bronchiseptica УГСХА BBR 57.

Для определения биохимических свойств выделенных культур использовали среды Гиса, среда № 6 ГРМ ВФС 42-3074-98, набор для ускоренного определения Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии биохимических свойств НИИЭМ им Пастера, а так же для определения сероводорода среду N 13 ГРМ ВФС 42-3236-98 - трехсахарный агар с солью железа, для определения индола использовали среду N 15 ГРМ ВФС 42-3205-98. Для определения утилизации цитрата – цитратный агар Симмонса ВФС 42-3344-99. Для определения оксидазной активности использовали 1% водный раствор 2 – n диметил-паранитрофенол, для определения наличия фермента каталазы 4% раствор перекиси водорода. Для определения желатиназы использовали МПБ по прописи с 30% желатина. Для определения гемолитической активности штаммов – ГРМ агар с 10% дифибринированной человеческой кровью. Для определения подвижности – “Метод висячей капли” и 0,7 % агар.

Схема выделения отрабатывалась на базе ветеринарной клиники ”Друг” ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Предлагаемая схема выделения:

Для типирования и дифференциации культур Bordetella bronchiseptica от других бактерий выбрали следующие свойства: сроки появления россинчатых колоний и рост на простом агаре до 48 часов; отсутствие пигмента и побурения сред;

грамотрицательные; наличие цитохромоксидазы; отсутствие ферментации углеводов и многоатомных спиртов (сахарозу, лактозу, глюкозу, манит и мальтозу);

подвижность; отношение к кислороду; высокая уреазная активность; наличие фермента каталазы; редукция нитратов; утилизация цитрата; отсутствие желатиназы; -гемолиз.

По предложенной нами бактериологической схеме выделено 54 штамма Bordetella bronchiseptica. Отмечено, что чаще бордетеллы выделяются от кошек всех возрастов с другими системными неинфекционными и вирусными заболеваниями (аденовироз), а у котят с клиническими признаками бронхопневмонии и ринотрахеита в возрасте 3-5-ти недель. Получены штаммы и от животных без клинических проявлений.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Предлагаемая схема позволяет выделить культуру Bordetella bronchiseptica в течение 96 часов.

1. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. Справочник под редакцией М.

А. Сидорова. М., 206 с.

УДК 616:

ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA

ISOLATION OF PHAGES BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In the domestic veterinary and medical practice, the question selection bacteriophage bacteria Bordetella bronchiseptica, and their use for diagnostic purposes has not been studied. Addressing these issues is of great scientific and practical interest, since phage diagnosis infections is low-cost, economical and effective method. The aim of our work was to study the possibility of separating phages B.bronchiseptica from pets and using the induction of bacteria with ultraviolet rays.

Каждый день в мире появляются новые опасные инфекции, вследствие которых гибнут миллионы людей и животных. В отечественной ветеринарной и медицинской практике вопрос выделения бактериофагов бактерий Bordetella bronchiseptica и их применения с диагностической целью не изучался [3].

Разработка диагностики малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом, таких, как бордетеллёз является крайне актуальной. Зарубежные ученые занимались выделением фага бордетелл путём индукции ультрафиолетовым лучом из профага, находящегося в бактерии [4]. Способы получения бордетеллёзных фагов от животных не описаны в литературе.

Решение этих вопросов представляет научный и практический интерес, так как фагодиагностика инфекций является малозатратным, экономичным и эффективным методом.

Вследствие актуальности проблемы целью нашей работы явилось изучение возможности выделения фагов B. bronchiseptica от домашних животных и при помощи индукции бактерий ультрафиолетовыми лучами.

Работа проводилась в научно-инновационном исследовательском центре микробиологии и биотехнологии УГСХА.

Выделение фагов от животных. Для проведения экспериментов были использованы животные вивариев в количестве 4-х собак и 6-ти кошек в возрасте от 6 месяцев до 1,5 лет. Для исследования подбирали животных с клиническими признаками воспаления верхних дыхательных путей: выраженное угнетение, температурная реакция, чихание, кашель, выделения из носовых отверстий.

Для выделения фагов мы использовали методы взятия глубоких мазков из глотки, истечений из носовой полости от живых животных и исследования патматериала (трахеи) от павших животных. Эти методы были апробированы нами ранее для выделения B. bronchiseptica от животных.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Животных фиксировали при взятии проб из носовой полости в стоячем или сидячем положениях, удерживая голову одной рукой за кожную складку на шее, а другой – за челюсти. При взятии проб из глотки в стоячем или сидячем положениях, разводя челюсти руками или с помощью инструментов. При взятии материала от павшего животного брали трубку трахеи длиной 5-6 см с содержимым.

Для взятия материала из носовой полости и глотки использовали стерильные ватные палочки и мясо-пептонный бульон. Палочки помещали в носовые ходы или глотку животных и совершали несколько вращательных движений, касаясь внутренней стенки носовой полости или глотки.

Затем в каждую пробирку с 9 мл МПБ добавляли исследуемый материал и мл суточной культуры 5-ти штаммов B. bronchiseptica и подращивали в термостате при t 37°С в течение 3-х суток. Далее добавляли хлороформ для бактрицидного эффекта, интенсивно взбалтывали в течение 15 минут, центрифугировали при об/мин 15 минут. Потом стерильными пипетками отсасывали надосадочную жидкость в количестве 3-4 мл и помещали в стерильную пробирку. Центрифугат исследовали по методу стекающей капли. Для этого на мясопептонный агар газоном засевали B. bronchiseptica и наносили пипеткой фильтрат. Культивировали в течение 12-18 ч при t 37°С и оценивали результаты.

При исследовании патматериала мы измельчали его и далее действовали по вышеуказанной методике.

Выделение фагов индукцией бактерий при помощи УФЛ.

1й день: Посев газоном суточной культуры B. bronchiseptica, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1метра, экспозиция 5-7 минут. Помещение чашек в термостат (37С) на сутки.

2й день: Распределение шпателем бактерий по поверхности агара. облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1метра, экспозиция 7-10 минут.

Помещение чашек в термостат (37С) на сутки.

3й день: Распределение шпателем бактерий по поверхности агара. облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5метра, экспозиция 7-10 минут.

Помещение чашек в термостат (37С) на сутки.

4й день: смыв МПБ с чашек, помещение в пробирку со штаммами бордетелл, кроме исходного. Культивирование в термостате сутки.

5й день: обработка хлороформом 1:10 в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку. Метод стекающей капли на все штаммы.

материала от живых животных (слизь из носа и глотки) получение фага не эффективно. При исследовании материала от павших животных (трахея) мы также не получили фаги B. bronchiseptica.

При облучении бактерий УФЛ нам удалось выделить фаги B. bronchiseptica.

На чашках Петри были обнаружены слабые зоны лизиса бактерий. Данные зоны располагались по пути стекания капель фаголизата.

Таким образом, из двух использованных нами методов, можно говорить об эффективности УФЛ при выделении бактериофагов из бактерий.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии 1. Адамс М. Бактериофаги. - М.: Медгиз, 1961. - 521 с.

2. Габрилович И.М. Лизогения. - Минск, 1970. - 72 с.

3. Mattoo, S., A. K. Foreman-Wykert, P. A. Cotter, and J. F. Miller. 2001. Mechanisms of Bordetella pathogenesis. Front. Biosci. 168-186.

4. Waldor, M. K., and J. J. Mekalanos. 1996. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science 272.

УДК 619:

БАКТЕРИИ ВИДА BACILLUS MEGATERIUM – ВОЗБУДИТЕЛИ ПОРЧИ

ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

BACTERIA OF TYPE BACILLUS MEGATERIUM – ACTIVATORS OF DAMAGE

OF FOOD STUFFS

О.А. Трусова, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, Д.С Золотухин O.A. Trusova, N.A. Feoktistova, D.A. Vasiliev, D.S.Zolonukhin Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In article literary data on pollution of food stuffs by bacteria of type Bacillus megaterium are analyzed, capable to cause damage of foodstuff.

Санитарно – микробиологические аспекты исследования продуктов питания широко представлены и отечественной и зарубежной литературе.

Микробиологические показатели продовольственных товаров зависят от исходной обсемененности, в первую очередь, термоустойчивыми бактериями, например, такими, как Bac. megaterium, так как увеличение срока хранения многих продуктов питания связано с их термической обработкой, с соблюдением мер предосторожности от повторного загрязнения.

Schonberg провел бактериологическое изучение причин порчи различных пищевых продуктов. Он установил, что среди выделяемых из пищевых продуктов микробных культур определялись и спорообразующие бактерии. В их числе чаще других были изолированы Bac. subtilis, Bac. mesentericus, Bac. megaterium и Bac.

cereus [6].

Rogers приводит результаты анализа микрофлоры, содер-жащейся в тесте, пшеничной муке и зернах пшеницы. Из образцов охлажденного теста и пшеничной муки выделены и идентифицированы 95 штаммов бацилл. Среди 53 штаммов, выделенных из охлажденною теста, 24 штамма - Вас. subtilis, 17 - Вас. cereus, 10 Вас. pumilis, 2 - Вас. licheniformis. Из пшеничной муки выделены Вас. pumilis - штаммов, Вас. subtilis - 10, Вас. brevis и Вас cereus - по два, Вас. coagulans, Вас.

licheniformis, Вас. rnegaterium - но одному. Из пшеницы выделили Вас. circulans - 6, Вас. subtilis - 3, Вас. cereus - 1, Вас. licheniformis - I штамм. Таким образом, исследованные продукты существенно отличались по числу и видам выделенных из них штаммов бацилл [6].

Kahalafallaet определял содержание спорообразующих бактерий в пробах молока буйволиц до и после термической обработки. Автор установил, что летом количество споровых бактерий в молоке этих животных больше, причем для проб, взятых в летнее время, был характерен и более широкий диапазон колебаний их численности. После термической обработки молока (60 мин при 100° С) сезонные Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии различия в содержании спорообразующих бактерий были значительно меньшими.

Важно и другое: если в сыром молоке из общего количества спорообразующих бактерий большинство составляли такие виды, как Вас. megateriurn, Вас. brevis, Вас.

subtilis, Вас. firmus, то после термообработки чаще обнаруживались Вас. subtilis, Вас.

coagulans, Вас. cereus.

Asnani и соавторами изолировал спорообразующие аэробные бактерии (Bac.

subtilis, Bac. megaterium) из плодов манго. Под влиянием этих бактерий ткань фруктов приобретает губчатое строение. Выделяющийся экссудат содержит бактерии, способствует развитию поражения. Из пшеничной муки выделен 1 штамм Bac. megaterium [6].

И.А. Еремина утверждает, что в молоке и молочных продуктах чаще всего встречаются Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus stearother-mophilus. Многие аэробные спорообразующие бактерии вызывают пороки молочных продуктов (горький вкус, преждевременное свертывание молока без повышения кислотности и др.) [2].

Результаты исследований Е.В. Глинской и Н.Ф. Пермяковой по изучению микрофлоры сырокопченых колбас промышленного производства свидетельствуют о том, что бактерии вида Bacillus megaterium выделяются наиболее часто. В ходе экспериментов авторами было изучено также влияние температурного фактора на биологические свойства и процесс спорообразования у бактерии вида Bacillus megaterium. Результаты исследований показали, что культивирование исследуемых штаммов при температуре +45 0С к споруляции не приводило, а лишь способствовало образованию внутриклеточных гранул, появлению инволюционных форм и различных типов колоний. Так, появление гранул наблюдалось у В.

megaterium через 20 часов культивирования. Штаммы В. megaterium образовывали изогнутые и S-образные формы клеток. При культивировании исследуемых штаммов в условиях повышенной температуры наблюдалось также образование нехарактерных для данных видов бацилл колоний: гладких, блестящих, часто слизистых, небольших размеров. Указанные адаптивные изменения являлись результатом приспособления микроорганизмов к новым условиям (повышенная температура) и реверсировали в исходную форму после прекращения действия вызвавшею их фактора. Выращивание исследуемых культур при температуре +16°С не сопровождалось образованием инволюционных клеточных форм, однако вызывало задержку роста (видимый рост на МПА наблюдался лишь через 90 часов культивирования) и спорообразования. Процесс споруляции у большинства исследуемых видов бацилл начинался лишь через 90-116 часов культивирования [3].

Прорастание спор проходит несколько стадий. Активация вызывается теплом, ионизирующим излучением, воздействием химических веществ и сопровождается повышением чувствительности к пусковым факторам, способствующим переходу к следующей стадии – инициации прорастания. Такими пусковыми факторами могут быть питательные компоненты – специфичные для спор разных видов и даже штаммов бактерий, поверхностно – активные вещества, ферменты, в частности лизоцим. Например, установлено, что пусковой фактор для прорастания спор Bac.

megaterium – добавление в среду аланина. В период инициации теряется устойчивость спор к факторам внешней среды и изменяются их рефракционные свойства; они выделяют Сa- дипиколиновую кислоту и компоненты деполимеризованного нетидогликана. Споры Bac. megaterium после добавления в среду аланина через 2-3 минуты начинают поглощать кислород, т.е. усиливается обмен веществ [5].

Интенсивное спорообразование бактерий Bacillus наблюдается на пептонно – кукурузном агаре, на разведённом МПБ. Установлено, что число спорулирующих клеток бацилл Bac. megaterium 14581 в разведённом в 10 раз водой МПБ, а также на Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии пептонно-кукурузном агаре в результате инкубации в течение 95-120 ч достигает 95% и выше [4].

Штамм Bac. megaterium D440 обладает цитохромами b,a 4-a3, o; а в состав дыхательной цепи штамма M входят цитохромы b,c,a,o. (Downs, Jones, 1975).

Различные виды споровых бактерий неодинаково относятся к источникам азота: одни лучше усваивают аммонийный азот, другие - хорошо потребляют азот нитратов, некоторые - нуждаются в аминокислотах. Типичные культуры Bac.

megaterium хорошо растут на среде с аммонийным источником азота, не нуждаются в аминокислотах и дополнительных факторах [6].

Установлена роль Mn в процессе спорообразования у Bac. megaterium. Mn необходим в качестве кофактора фосфатглицеромутазы, которая является строго зависимым ферментом, необходимым для процесса споруляции в нормальной питательной среде [6].

Изучению ИК-спектров клеток спорообразующих бактерий посвящено лишь несколько исследований, из которых только в работе Haynes (1958) сделаны попытки таксономического использования полученных спектров. На основании полученных результатов все исследуемые штаммы разных видов бацилл были разделены на две группы. Первая группа включала представителей видов, спектры клеток которых содержали полосу: Bac. cereus, Bac. megaterium [3].

Анализ публикаций показывает, что бактерии вида Bacillus megaterium широко распространены в пищевых продуктах, вызывают их порчу, а также недостаточно изучены, и, как следствие, могут быть опасны в плане возникновения пищевых отравлений.

1. Глинская Е.В., Пермякова Н.Ф. гетерогенность свойств бактерий рода Bacillus, выделенных из колбасных изделий //Фундаментальные исследования, 2004. С.123-125.

2. Еремина И.А. Микробиология молока и молочных продуктов. – Кемерово:

КТИПП, 2004. – С.15.

3. Жвирблянская А.Ю., Бакушинская О.А. Микробиология в пищевой промышленности. – М.: Пищевая промышленность, 1966. – С. 134.

4. Заварзин Г.А. Фенотипическая систематика бактерий: Пространство логических возможностей. – М.: Наука, 1974. – С.137.

5. Красильников Н.А. Определитель бактерий и актиномицетов. – М.-Л., Изд-во АН СССР, 1949. – С.56.

6. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ – Киев: Наукова Думка, 1982. – С.117-137.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619:

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВЫДЕЛЕННЫХ ФАГОВ

БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS SUBTILIS

STUDYING OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE ALLOCATED PHAGES OF

BACTERIA OF TYPE BACILLUS SUBTILIS

Н.А. Феоктистова, А.Х. Мустафин, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев N.A. Feoktistova, A.H. Mustafin, A.I. Kakdirkaev, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In article the characteristic is given to biological properties of phages of bacteria of type Bacillus subtilis (morphology of negative colonies, the spectrum of lytic action, lytic activity).

Изучение биологических свойств фагов проводили по методикам, предложенным М. Адамсом [1], А.С. Тихоненко [9], Т.Г. Чинашвили [10], И.М.

Габриловичем [3].

Целью наших исследований было изучение следующих свойств выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis:

- морфология негативных колоний, - спектр литического действия, - литическая активность.

Морфологию негативных колоний выделенных бактериофагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев по Грациа. Учет проводили через 24 часа инкубации при температуре 33 0С.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Изучение морфологии негативных колоний выделенных бактериофагов показало, что их можно сгруппировать в два типа негативных колоний [2]:

1 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0-2,5 мм в диаметре (фаги С-3, С-4, С-5, С-8, С-10, С-15, С-19 С-9, С-12, С-14, С-17, С-18, С- серии УГСХА);

2 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 2,6-4,0 мм в диаметре (фаги С-1, С-2, С-11, С-16, С-13, С-20, С-21 серии УГСХА).

Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили методом пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной И.М. Габриловичем [4], С.Н.

Золотухиным [7].

Для этого исследуемый бактериофаг засевали по методу агаровых слоев по Грациа, используя разведения 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10,чтобы на питательной среде культивирования в термостате одну негативную колонию, расположенную от других не менее чем в 10 мм, отвивали бактериологической петлёй на мясопептонный бульон, туда же вносили индикаторную культуру Bacillus subtilis в количестве 0,2 мл.

Одновременно ставился контроль: мясопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой Bacillus subtilis в количестве 0,2 мл. Пробирки культивировали в термостате при 33 0С в течение 5 часов. Полученный фаголизат прогревали в водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут и исследовали методом агаровых слоев по Грациа, затем отбирали негативную колонию идентичную исходной, с которой вновь проводили такую же операцию.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Морфология негативных колоний выделенных фагов бактерий вида название фага.

Bacillus subtilis 61/ С- Прозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 3/ С- Bacillus subtilis 3П/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 98/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 8/ С- Bacillus subtilis 21/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 17/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 5 /С- Bacillus subtilis 16 /СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 32/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 10/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 12/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 26/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 23/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 12 /СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 4/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 19/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 4/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 31/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 25/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 27/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Bacillus subtilis 14/ СПрозрачные негативные колонии, округлой формы с Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Спектр литической активности является одной из основных характеристик диагностического препарата фага. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры [1, 5].

Для изучения спектра литической активности селекционированных нами изолятов фагов было использовано 30 полевых и 5 штаммов бактерий Bacillus subtilis из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3- капли 18-ти часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут. Чашку делили бактериологическим карандашом на два сектора. На поверхность засеянной среды в первом секторе пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили исследуемый фаг и наклоняли, чтобы капля стекла, на второй сектор аналогичным образом наносили МПБ (для контроля), затем инкубировали при температуре 33 0С, оценку результатов проводили через 18 часов.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Спектр литической активности выделенных фагов Анализируя данные таблицы 2, нужно отметить, что бактериофагов, лизирующих только один штамм, обнаружено не было, а максимальное количество штаммов (по 17) лизировали 2 сублилисных фага С-13 УГСХА и С-16 УГСХА. Все выделенные фаги обладали перекрестным лизисом. Совокупный процент лизиса субтилисных культур бактериофагами С-13 УГСХА и С-16 УГСХА составил 64,4 %.

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем максимальным разведением, в котором испытуемый Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако этот показатель относительный, так как активность фага зависит от различных условий, основными из которых являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят от физических свойств среды, ее химического состава, окружающей температуры и так далее. Поэтому активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях.

Культуры бактерий вида Bacillus subtilis для определения литической активности бактериофагов выращивали на стандартном мясопептонном бульоне в течение 18 часов.

Литическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методу Аппельмана и Грация [8].

Определение литической активности фага по методу Аппельмана: в ряд пробирок из нейтрального стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл бульона. В первую пробирку вносили 0,5 мл исследуемого протейного фага. Затем делали последовательные разведения, перенося отдельными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл бактериофага. Использовали 10 пробирок. Из последней пробирки 0,5 мл выливали в дезинфицирующий раствор, затем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. 11 и 12 пробирки являются контрольными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все 12 пробирок помещали в термостат при 33 0С на 18 часов. Титр фага устанавливали по последней прозрачной пробирке ряда и выражали разведением фага.

Также литическую активность определяли методом агаровых слоев.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Литическая активность субтилисных бактериофагов по Аппельману Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Согласно данных таблицы 3, нужно отметить, что выделенные субтилисные бактериофаги обладали разной литической активностью в диапазоне от 10 –5 до 10-8, оценивая ее по Аппельману. Максимальный титр - 10-8 - отмечен у бактериофагов СУГСХА и С-16 УГСХА. Изученные фаги характеризовались различным спектром литической активности, оценивая ее методом агаровых слоев по Грациа. Он колебалась от 1,7х106 до 3,0х109. Максимальный титр был зафиксирован у бактериофагов С-13 УГСХА и С-16 УГСХА и составил 2,8х109 и 3,0х соответственно.

Анализируя результаты изучения биологических свойст выделенных нами фагов бактерий вида Bacillus subtilis, нужно отметить, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым субтилисным культурам обладали фаги С-13 УГСХА и С-16 УГСХА, лизировавшие по 17 из изучаемых штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, что равно 64,4 %. Литическая активность, определяемая по методам Аппельмана и Грациа, этих фагов была максимальной из 22 выделенных.. Учитывая вышеизложенные результаты, фаги С-13 УГСХА и С- УГСХА были выбраны нами для конструирования диагностического препарата, предназначенного для индикации и идентификации бактерий вида Bacillus subtilis в объектах санитарного надзора.

1. Адамс М. Бактериофаги. – М., 1961. – С. 26-121.

2. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов E. coli О124:В17 // Проблемы бактериофагии и биологии кишечных бактерий: Сб. кафедры микробиологии 1 Лен. Мед. ин-та им. акад. И.П.

3. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // Основы 4. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences //ЖМЭИ. – 1992. – №6. – С.10-12.

5. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. – Ульяновск. – 1988. – С.45.

6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-184.

7. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореф. дис. … канд.

8. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай, 1978. – С. 41-88.

9. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М.: Наука, 1968. – 10. Чинашвили Т.Г. К механизму образования фагоустойчивых форм микроорганизмов // В кн.: Вопросы молекулярной генетики микроорганизмов. – М.,1968. – С.225.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619:

ЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS CEREUS

LYTIC ACTIVITY BACTERIOPHAGE BACILLUS CEREUS

Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин N.A. Feoktistova, A.I. Kaldirkaev, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In article results of researches on studying lytic activity bacteriophage Bacillus cereus are reflected.

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако этот показатель относительный, так как активность фага зависит от различных условий, основными из которых являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят от физических свойств среды, ее химического состава, окружающей температуры и так далее. Поэтому активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях.

Культуры бактерий Bacillus cereus для определения литической активности бактериофагов выращивали на стандартном мясопептонном бульоне в течение часов.

Литическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методу Аппельмана и Грация [1].

Определение литической активности фага по методу Аппельмана [2]: в ряд пробирок из нейтрального стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл бульона. В первую пробирку вносили 0,5 мл исследуемого протейного фага. Затем делали последовательные разведения, перенося отдельными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл бактериофага. Использовали 10 пробирок. Из последней пробирки 0,5 мл выливали в дезинфицирующий раствор, затем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. 11 и 12 пробирки являются контрольными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все 12 пробирок помещали в термостат при 33 0С на 18 часов. Титр фага устанавливали по последней прозрачной пробирке ряда и выражали разведением фага.

Также литическую активность определяли методом агаровых слоев по Грациа [3]. Накануне опыта по чашкам разливали 1,5 % мясопептонный агар. Перед использованием чашки подсушивали в термостате 15-20 минут. Индикаторные выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 33 0С на мясопептонном бульоне. Стерильно подготовленный 0,7 % мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли и остужали до 46-48 0С. Исследуемый на наличие бактериофага субстрат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7 % мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5 % МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, затем чашки оставляли на горизонтальной Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии поверхности с приоткрытыми крышками на 30 минут до полного застывания агара, затем инкубировали в термостате при 33 0С в течение 18-20 часов.

Рис. Рост бактериофагов на мясо-пептонном агаре (метод Грациа) Результаты исследований представлены в таблице и на рисунке.

Литическая активность протейных бактериофагов № бактериофага Из данных таблицы, видно, что выделенные цереусные бактериофаги обладали разной литической активностью в диапазоне от 10–6 до 10-8, оценивая ее по Аппельману. Максимальный титр - 10-8 - отмечен у бактериофагов Ф-4 УГСХА и Ф-6 УГСХА. Изученные фаги характеризовались также различными показателями литической активности, оценивая ее по методу агаровых слоев. Диапазон показателей составил от 2,8х107 до 2,0х109. Максимальный титр был зафиксирован у бактериофагов Ф-4 УГСХА и Ф-6 УГСХА и составил 1,2х109 и 2,0х109 соответственно. Фаги с высокими показателями литической активности необходимо в дальнейшем подвергнуть более глубокому изучению, так как этот показатель чрезвычайно важен при создании экспериментального биопрепарата на основе бактериофагов Bacillus cereus.

1. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. – Ульяновск. – 1988. – С.45.

2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-184.

3. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай, 1978. – С. 41-88.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619:

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS SUBTILIS ИЗ ОБЪЕКТОВ

САНИТАРНОГО НАДЗОРА

ALLOCATION OF BACTERIA OF TYPE BACILLUS SUBTILIS FROM OBJECTS

OF SANITARY INSPECTION

Н.А. Феоктистова, А.Х. Мустафин, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев N.A. Feoktistova, A.H. Mustafin, A.I. Kaldirkaev, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In article the way of allocation of bacteria of type Bacillus subtilis from objects of sanitary inspection, a procedure of identification of data бацилл on some biological properties is described.

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий вида Bacillus subtilis из объектов санитарного надзора. В период с 2008 по 2010 годы было исследовано на наличие бактерий вида Bacillus subtilis 74 пробы пищевых продуктов, купленных на продовольственных рынках г. Ульяновска, г. Самары, г.

Геленджика, г. Сочи и г. Сенгилея.

Исследуемые пробы измельчали в ступке при помощи пестика, вносили в физиологический раствор в соотношении 1:10 и прогревали на водяной бане при температуре 70-75 0С в течение 30 минут.

Для выделения и идентификации бактерий группы Baсillus subtilis в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР разработана элективная питательная среда, которая имеет преимущества перед обычными средами, применяемыми для их изолирования [1].

Состав: глюкоза - 10 г., K2HPO4 – 1 г., NaCl – 0,1 г., MgSO4 х7H2O – 0,5 г., CaCl х 6H2O – 0,1 г., CuCl2 х 2H2O – 0,001 г., Na2MoO4 х 2H2O – 0,005 г., CoCl х 6H2O – 0,005 г., MnCl2 – 0,005 г., цитрат натрия – 0,5 г., d,l – – аланин – 2,5 г., d, l – валин – 2,5 г., полимиксин – 120 000 ед., водопроводная вода – 1000 мл.

Для приготовления среды мы использовали рабочие растворы, которые готовили заранее. Глюкозу использовали в 40 % - ной концентрации и стерилизовали при давлении 0,5 атм. Растворы двузамещенного фосфорнокислого калия, хлористого натрия, сернокислого магния (гидрата), хлористого кальция (гидрата) и цитрата натрия готовили в десятикратной концентрации по сравнению с прописью, стерилизовали при 1,5 атм. Отдельно готовили растворы микроэлементов:хлоной меди (гидрат), молибденовокислого натрия (гшидрат), хлористого марганца, где каждое вещество брали в десятикратном количестве. d, l – – аланин и d, l – валин использовали в 4%-ной концентрации. Растворы микроэлементов и аминокислот стерилизовали при 1,5 атм. В стерильную колбу наливали по 10 мл растворов солей, 10 мл раствора микроэлементов, 20-30 мл раствора глюкозы; по 60 мл растворов d, l – – аланина и d, l – валина; доводили объем смеси стерильной дистиллированной водой до 1л. Антибиотик полимиксин разводили стерильной дистиллированной водой и добавляли в среду в количестве 0.01-0,013 г/л непосредственно перед использованием. Срок хранения среды составлял пять-семь дней.

Элективную питательную среду разливали стерильно в пробирки по 5 мл и засевали по 0,1 мл. исследуемой пробы. Посевы помещали в термостат при 33 0С на четыре-пять дней. При наличии роста посевы прогревали при 70-75 0С в течение Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии мин. и делали высевы на агаризованные питательные среды для изолирования чистых культур. Прогревание выросших культур было необходимо, так как установлено, что в отдельных случаях на элективной среде наблюдается рост отельных штаммов Pseudomonas, которые при последующем высеве на твердые среды могут подавлять спорообразующие бактерии.

Выделенные культуры - грамположительные короткие палочки с закругленными концами и центрально расположенной спорой.

Рис. 1 – Бактерии вида Baсillus subtilis (рост на мясо-пептонном агаре) Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения морфологических и культуральных, биохимических свойств. Ферментативные свойства изучали у агаровых культур бактерий, выделенных из одного исследуемого материала, на наборе полужидких сред с углеводами и индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на среде с лизином, среде с фенилаланином и т.п. В качестве дополнительных тестов определяли подвижность микроорганизмов. Посевы инкубировали при температуре 33-34 0С в течение 24-48 часов.

Выделенные нами подвижные культуры хорошо росли в среде с 7 % хлористого натрия, разлагали глюкозу, сахарозу, не разлагали лактозу, давали положительную реакцию при взаимодействии с сорбитом, маннозой и арабинозой, уреазой, маннитом; не взаимодействовали с триптофандезаминазой, лизиндекарбоксилазой и фенилаланиндезаминазой; разжижали желатин. Также мы наблюдали гидролиз крахмала и разложение казеина; положительный результат реакции Фогеса-Проскауэра. Тест на лецитиназу не может считаться типовым, так как 55% культур давали положительный результат, а 45% - культур – отрицательный.

Полученные данные по изучению биохимических свойств выделенных нами бацилл были сравнены с результатами исследований биохимических свойств штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА. Выделенные нами из объектов санитарного надзора культуры обладают биохимическими свойствами, аналогичными свойствам музейных культур Bacillus subtilis (УГСХА).

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии В результате проведенных исследований нами было выделено объектов санитарного надзора 30 культур бактерий, которые мы типировали по ферментативным свойствам (на основании тестов, описанных в литературных источниках и результатах изучения биохимических свойств штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА) и отнесли к виду Bacillus subtilis.

Использование элективной среды для выделения бактерий вида Bacillus subtilis позволяет сократить сроки выделения культур, однако, мы считаем, что изучение биохимических свойств выделенных бактерий также обязательно, так как бациллы – это до сих пор малоизученная группа микроорганизмов.

Из данных таблицы видно, что источники выделения бактерий вида Bacillus subtilis различны: это мясо, мясной фарш, специи, молоко, мука, что говорит о широком распространении данных бактерий и их устойчивости к условиям окружающей среды.

Выделенные культуры бактерий вида Bacillus subtilis №1 - Bacillus subtilis №2 - Bacillus subtilis №3 - Bacillus subtilis №4 - Bacillus subtilis №5 - Bacillus subtilis №6 - Bacillus subtilis №7 - Bacillus subtilis №8 - Bacillus subtilis №9 - Bacillus subtilis №10 - Bacillus subtilis №11 - Bacillus subtilis №12 - Bacillus subtilis № 13 - Bacillus subtilis № 14 - Bacillus subtilis №15 - Bacillus subtilis №16 - Bacillus subtilis № 17 - Bacillus subtilis № 18 - Bacillus subtilis Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии №19 - Bacillus subtilis №20 - Bacillus subtilis №21 - Bacillus subtilis №22 - Bacillus subtilis №23 - Bacillus subtilis №24 - Bacillus subtilis №25 - Bacillus subtilis №26 - Bacillus subtilis №27 - Bacillus subtilis №28 - Bacillus subtilis №29 - Bacillus subtilis №30 - Bacillus subtilis В последнее время исследователи обращают внимание на встречаемость в пищевых продуктах токсигенных культур этой группы, наличие у них факторов патогенности. Однако вследствие недооценки возможной роли бацилл в патологии человека и животных большинство авторов не исследовали токсичность выделенных культур.

Нами были проведены исследования по изучению патогенных свойств выделенных культур бактерий. Исследования проводились биопробой на белых мышах методом внутрибрюшинного введения 0,5 млрд. микробных клеток. Для этого использовали суточные бульонные культуры бактерий. Взвесями каждого вида бактерий заражали по три белых мыши. Культуру признавали патогенной в случае гибели двух или более мышей в течение трех суток после заражения и относили ее к возбудителям болезни. Из 30 протестированных штаммов – 34 % - культур были признаны патогенными, так как их воздействие на организм белых мышей было летальным, а после вскрытия изучаемая культура была выделена из ЖКТ мыши.

При исследовании 74 проб на элективной питательной среде нами было выделено 30 штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, что составило 41 % случаев.

Этот показатель свидетельствует о высокой степени контаминации объектов санитарного надзора (на территории Ульяновской, Самарской областей и Краснодарского края) бактериями вида Bacillus subtilis, одна треть из которых обладает явно выраженными патогенными свойствами. Употребление в пищу продуктов, обсемененных бактериями вида Bacillus subtilis, может привести к пищевому отравлению.

1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ – Киев: Наукова Думка, 1982. – С.106-107.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619:

ПОИСК ФАГОВ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS SUBTILIS

SEARCH OF PHAGES OF BACTERIA OF TYPE BACILLUS SUBTILIS

Н.А. Феоктистова, А.Х. Мустафин, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев N.A. Feoktistova, A.H. Mustafin, A.I. Kaldirkaev, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In article ways of allocation of phages of bacteria of type Bacillus subtilis from objects of an environment, from a prophage, from cultures of bacteria Bacillus subtilis without influence on them of the inducing factor are described.

Первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги бактерий вида Bacillus subtilis из имеющихся 35 штаммов бактерий вида Bacillus subtilis. Мы рассчитывали обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью [2,3].

В первой серии опытов использовали методику, предложенную С. Лурия, Д.

Дарнеллом [4], для выделения бациллярных бактериофагов из бактерий без воздействия на них индуцирующего фактора.

Сущность методики: в 1,0 литровую колбу, содержащую 0,5 литра мясопептонного бульона, добавляли по 1,0 мл 18 часовых культур всех имеющихся у нас штаммов Bacillus subtilis. Колбу ставили в термостат при 33 0С на 24 часа. Затем смесь бактерий центрифугировали при 2000 об./мин в течение 30 минут, затем прогревали на водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали на наличие фага методом агаровых слоев по Грациа [5] на имеющихся у нас штаммах Proteus.

Метод посева агаровыми слоями по Грациа. Накануне опыта по чашкам разливали 1,5 % мясопептонный агар. Перед использованием чашки подсушивали в термостате 15-20 минут. Индикаторные выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 33 0С на мясо-пептонном бульоне. Стерильно подготовленный 0,7 % мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли и остужали до 46-48 0С. Исследуемый на наличие бактериофага субстрат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7 % мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5 % МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, чашки оставляли на горизонтальной поверхности с приоткрытыми крышками на минут до полного застывания агара, затем инкубировали в термостате при 33 0С в течение 18-20 часов.

В результате проведенных исследований было установлено, что выделение бактериофагов из культур бактерий Bacillus subtilis без воздействия на них индуцирующего фактора не приводило к появлению свободного фага.

Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, в течение 15, 30 и 45 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18,0 %, мощности которой приходится на область 254 нм.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Bacillus subtilis методом агаровых слоев по Грациа.

Проведя эти исследования, нам не удалось выделить бактериофаги бактерий вида Bacillus subtilis из имеющихся у нас штаммов бактерий Bacillus subtilis.

В наших исследованиях мы не обнаружили перехода профага в свободный фаг у имеющихся штаммов бактерий вида Bacillus subtilis по вышеизложенным методикам, поэтому дальнейшие исследования были посвящены выделению бактериофагов Bacillus subtilis из объектов внешней среды по методике Л.И.

Адельсона. Для проведения исследований мы брали пробы пищевых продуктов, почвы, сточных вод из частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей.

Сточные воды фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей. Навеску почвы разводили для исследований в соотношении 1:10 физиологическим раствором. Аналогично мы готовили для исследования пробы пищевых продуктов: первоначально пробу растирали в ступке при помощи пестика, затем делали разведения в соотношении 1:10 физиологическим раствором. В 1, литровую колбу, содержащую стерильный, МПБ в количестве 0,5 литра, вносили 50,0 мл фильтрата сточных вод или пробу почвы (пищевых продуктов) в концентрации 10-1 и по 1,0 мл всех имеющихся у нас штаммов бактерий Bacillus subtilis. Таким образом, каждая проба испытывалась на наличие фагов ко всем имеющимся культурам Bacillus subtilis. Колбу помещали в термостат и инкубировали в течение 24 часов при 33 0С. После этого содержимое колбы разливали в стерильные пробирки, центрифугировали при 1000 об./мин в течение 30 минут, затем прогревали в водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут. Исследуемые фильтраты исследовали методом агаровых слоев по Грациа. Чашки ставились в термостат на 18-20 часов при 33 0С. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало бы о присутствии в исследуемом материале бактериофага.

Негативные колонии отвивали в МПБ с индикаторными культурами. Для этого в две пробирки с 4,5 мл мясопептонного бульона (рН 7,4-7,6) добавляли стерильной пипеткой 0,2 мл 18 - часовой бульонной индикаторной культуры Bacillus subtilis. В одну из пробирок отвивали негативную колонию, а вторая пробирка служила контролем. Посевы помещали в термостат и инкубировали их при 33 0С до выраженного помутнения контроля. Затем содержимое опытной пробирки освобождали от микробных клеток прогреванием в водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут. Прогретый фильтрат переносили стерильной пипеткой в пробирку и использовали для проведения пассирования фага. Для получения чистой линии фага проводили до десяти пассажей из изолированных негативных колоний. В результате исследований 10 проб сточных вод, 32 проб почвы и 40 проб пищевых продуктов нам удалось по указанной схеме выявить 22 изолята фагов.

В ходе проведенных исследований бактериофаги субтилиса были выделены в 1 пробе пищевых продуктов (изучались специи, мясные и молочные продукты, мука, хлебобулочные изделия), 8 пробах сточных вод частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей и из 13 проб почвы, взятых в частных хозяйствах Ульяновской и Самарской областей.

Как показали результаты исследований, использование методики выделения бактериофагов из объектов внешней среды, разработанной Л.И. Адельсоном (1962), дало наилучшие результаты.

1. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам // Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии. – М., 1962. – С. 184-194.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии 2. Бабков В.В., Ленц Э.К. О лизогении среди энтеропатогенных кишечных палочек серологических групп О111: В4, О26:В6 и О124; В17 // Проблемы бактериофагии и биологии кишечных бактерий: Сб. кафедры микробиологии 1 Лен. Мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова. – Л.,1973. – С.163.

3. Жугова Т.Ч. Бактериофаги Yersinia enterocolitica: // Автореф. дис. … канд.

4. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология – М.: Мир,1970. – С.36-47.

5. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай, 1978. – С. 41-88.

УДК 619:

БАКТЕРИИ ВИДА BACILLUS MESENTERICUS – ВОЗБУДИТЕЛИ ПИЩЕВЫХ

ОТРАВЛЕНИЙ

BACTERIA OF TYPE BACILLUS MESENTERICUS – ACTIVATORS OF FOOD

POISONINGS

Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина, Д.А. Васильев, И.Р. Хусаинов N.A. Feoktistova, M.A. Udina, D.A. Vasiliev, I.R. Husainov Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и The research innovation centre of microbiology and biotechnology In article literary data on infection of food stuffs with bacteria of type Bacillus mesentericus are analyzed, or the potato stick, capable to cause food poisonings the person.

В последнее время очень актуальным становится вопрос о здоровой и полезной пище, о способах самозащиты от недобросовестных производителей продуктов питания, о методиках «обезвреживания» еды. Популярные телевизионные передачи много рассказывают о некоторых микроорганизмах, контаминирующих пищевые продукты, названия которых на данных момент знакомы многим рядовым потребителям, например: сальмонелла, кишечная палочка, клостридия ботулинус. Но остается большая группа микроорганизмов, которая не так широко известна рядовому потребителю, но может привести его не только на больничную койку, но и «отправить на тот свет»….

Целью наших исследований является анализ данных по контаминации продуктов питания бактериями вида Bacillus mesentericus, или картофельной палочкой.

«Bacillus mesentericus представляет собой крупную грамположительную палочку с закругленными концами и спорой, расположенной в центре клетки. На мясо-пептонном агаре образуют колонии с морщинистой слизистой поверхностью.

По ферментативным свойствам имеет сходство с сенной палочкой (Bacillus subtilis), поэтому их объединяют в группу картофельно-сенных бацилл. Вегетативные клетки подвижны, грамположительны, образуют овальные споры, при этом клетки не раздуваются, а сохраняют свою цилиндрическую форму. Колонии желто-бурые, сухие, морщинистые. На поверхности жидких сред картофельная палочка образует мощную складчатую пленку, на ломтиках картофеля - складчатый налет (отсюда название). Желатину разжижает, молоко подщелачивает и пептонизирует, образует кислоту из глюкозы, сахарозы и мальтозы, крахмал не разлагает. Картофельная палочка широко распространена в природе (в почве, пищевых продуктах и пр.).

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Споры ее, попадая вместе с мукой или дрожжами в тесто, не погибают при выпечке хлеба и, прорастая, могут вызвать «тягучую», или «картофельную», болезнь хлеба (мякиш хлеба становится слизистым и тягучим, и хлеб приобретает неприятный запах)», - такую характеристику дают Bacillus mesentericus в энциклопедических словарях и на аналогичных сайтах.

Более подробную характеристику данного микроорганизма можно получить, проанализировав работы ученых – микробиологов за последние десятилетия.

Бактерии вида Вас. mesentericus – возбудители широко распространенной микробной порчи хлеба, называемой картофельной болезнью. Чаще ими поражаются хлебобулочные изделия из пшеничной муки, так как они имеют более низкую кислотность. Активно развивается при 30 - 40 °С в зерне, муке, хлебе. Резко ухудшает органолептические свойства хлеба. Споры картофельной палочки выдерживают нагревание до 109 - 113 °С в течение 45 мин, кипячение - нескольких часов. При помоле зерна бактерия попадает в муку. Ее развитие в тесте подавляют повышением кислотности (добавлением уксусной кислоты). Бурно развивается в мякише хлеба при медленном охлаждении после выпечки в условиях хранения при повышенной положительной температуре. Хлеб портится, мякиш становится липким и тягучим, приобретает неприятные запах и вкус. Разрушение хлеба и появление запаха происходят под действием выделяемых бактерией ферментов, гидролизующих белки и крахмал. Такой хлеб непригоден для употребления. Анализ статистических данных за 2000-2003 гг., проведенный Пельц О.В. с соавт., свидетельствует, что в связи с переходом мукомольных производств в России на отечественное продовольственное сырье, отмечается рост картофельной болезни хлеба – процент нестандартных проб в 2003 году вырос по сравнению с 2000 годом на 8,8 %. Также следует отметить, что в критериях оценки качества муки уровень загрязнения муки возбудителями картофельной болезни хлеба отсутствует. Также есть данные, что проблема картофельной болезни хлеба актуальна и для Казахстана [7].

Так, B.А. Мирзоева в своих работах неоднократно подчеркивала существенную роль Bacillus subtilis и Вас. mesentericus в порче молочных продуктов, кондитерских изделий, сахарных сиропов, консервов, зерновых, хлебных и других продуктов [6]. Ее мнение разделяли также C.П. Аскалонов и А. И. Ильченко, которые обращали внимание на то, что Вас. mesentericus может обсеменять различные пищевые продукты (хлеб, мясо и др.), вызывая нередко их порчу [1].

Вас. mesentericus относится к микроорганизмам, вырабатывающим протеолитические ферменты, которые расщепляют белок до конечных продуктов, поэтому называется «микробом гниения». Процесс психрофильного поверхностного гниения протекает в 5 фаз и, как известно, сопровождается сменой микроорганизмов. В первой фазе очень медленно развиваются бактерии рода Bacillus (Bacillus subtilis и Вас. mesentericus) [5]. Sofletea описал «размягчение колбасных изделий». Возбудителями этого процесса они называют бактерии группы Вас. mesentericus-subtilis, которые вызывали порчу колбасных изделий в течение двух - шести дней после изготовления [9]. Микробиологическое исследование большого количества проб мясного фарша провела Е. Динчева в Болгарии. При исследовании более 200 партий фарша установлено, что общее количество бактерий колебалось в пределах 106 - 1010 клеток/г. После хранения фарша при температуре 4° С в течение 48 ч количество бактерий увеличивалось в два - восемь раз. Спорообразующие аэробные бактерии - преимущественно Вас. mesentericussubtilis, Вас. pseudoanthracis (31,5% проб) - обнаружены в трети проб [9].

Проведенные нами исследования по изучению микробиологического пейзажа мяса (свинины, говядины, баранины), реализуемого на продовольственных рынках г.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Ульяновска, подтверждают вышесказанное – бактерии вида Вас. mesentericus выделены в 30 % случаев.

В состав остаточной микрофлоры мясных и мясо-растительных консервов входят бактерии вида Вас. mesentericus. Для выявления остаточной микрофлоры, способной развиваться, после стерилизации консервы подвергают косвенном) микробиологическом) контролю - 5- 10%-ной термостатной выдержке при 37°С в течение 10 сут. Если в консервах перед стерилизацией установлены повышенная общая микробная обсемененность, наличие спор анаэробных клостридий или термофильных аэробов возбудителей плоскокислой порчи, то они подлежат 100%ной термостатной выдержке. За это время сохранившие жизнеспособность споры микроорганизмов могут прорасти. Затем вегетативные формы их будут размножаться и вызовут порчу продукта, определяемую наружным осмотром (бомбаж или течь на лопнувших банках). Однако термостатная выдержка недостаточный критерий для заключения о промышленной стерильности консервов.

При длительном хранении консервов, подвергнутых термостатированию, иногда вновь выявляются бомбажные банки. Это объясняется, во-первых, тем, что температура термостатной выдержки (37°С) не является оптимальной для всех микроорганизмов остаточной микрофлоры консервов, среди которых много термофилов, активно проявляющих свою жизнедеятельность при более высоких температурах. Во-вторых, споры микроорганизмов, ослабленные стерилизацией, часто не успевают прорасти в течение 10 дней и проявляют свою жизнедеятельность значительно позже. Например, споры Вас. subtilis и Вас.

mesentericus споры прорастают при 37°С только после 20 - 27-дневной выдержки [5].

Объектом наших исследований также была группа мясных и мясо-растительных консервов, вырабатываемых различными производителями на территории Российской Федерации – бактерии вида Вас. mesentericus были выделены в 5 % проб.

О выделении бактерий из кондитерских изделий, пищевых дрожжей, консервов, хлебо-булочных изделий и даже алкогольных напитков бактерии группы Вас. mesentericus-subtilis сообщают Л. Ю. Медвинская, Kalember, Рахимберлина [9].



Pages:     | 1 | 2 || 4 |
Похожие работы:

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/7/18 РАЗНООБРАЗИИ 10 November 2003 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Седьмое совещание Куала-Лумпур, 9-20 и 27 февраля 2004 года Пункт 20.1 предварительной повестки дня* ФИНАНСОВЫЕ РЕСУРСЫ И МЕХАНИЗМ ФИНАНСИРОВАНИЯ (СТАТЬИ 20 И 21) Дополнительные финансовые ресурсы Записка Исполнительного секретаря I. ВВЕДЕНИЕ 1. В преамбуле Конвенции о биологическом разнообразии признается, что...»

«The study of the life strategies of bryophytes fortifications Molotov Line (68th fortification) (World War II) in the vicinity of the Avgustov canal. In identified 62 species of mosses, more than half are patients as to the basic life strategy bryophytes in these growing conditions. Сакович А.А., Гродненский государственный университет имени Янки Купалы, Гродно, Беларусь, e-mail: anastasia_pryaz@inbox.ru. Рыковский Г.Ф., Институт экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича, Минск, Беларусь,...»

«Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий ФЦП по приоритетному направлению МГУПП Рациональное природопользование ГОУ ВПО МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ (МГУПП) ГОУ ВПО Московский ГНУ Всероссийский научногосударственный исследовательский институт университет прикладной крахмалопродуктов РАСХН биотехнологии (МГУПБ) (ВНИИКП) КОМПЛЕКСНАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОТХОДОВ АПК И УПАКОВКИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ С ПОЛУЧЕНИЕМ ИЗ НИХ ВТОРИЧНОГО СЫРЬЯ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ...»

«ФОРМА ЗАЯВКИ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ МАТЕРИАЛОВ Министерство природных ресурсов и экологии на участие в конференции: Заявки и материалы, объемом до 5 страниц Российской Федерации (включая таблицы, рисунки и библиографический Фамилия Управление Федеральной службы список), принимаются в печатном и электронном по надзору в сфере природопользования виде до 12 мая 2014 г. по Кировской области Имя Федеральное государственное бюджетное Электронный вариант: стандартный формат Word учреждение Государственный...»

«ЭКОЛОГИЯ РЕЧНЫХ БАССЕЙНОВ ЭРБ – 2007 IV МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ 28-30 сентября 2007 года ТРУДЫ ECOLOGY OF THE RIVER`S BASINS ERB – 2007 IV INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE (September, 28-30, 2007) PROCEEDINGS ВЛАДИМИР VLADIMIR 2007 УДК 556 ББК 26.222.5л0 Э40 ЭКОЛОГИЯ РЕЧНЫХ БАССЕЙНОВ: Труды 4-й Междунар. науч.-практ. конф. / Под общ. ред. проф. Т.А. Трифоновой; Владим. гос. ун-т. Владимир, 2007. – 526 с. Публикуются труды IV конференции Экология речных бассейнов,...»

«Материалы второй Международной научно-рактической интернет-конференции Лекарственное растениеводтво:от опыта прошлого к современным технологиям - Полтава, 2013 УДК 58(470.57) Миронова Л.Н., заведующая лабораторией Шипаева Г.В., научный сотрудник, Реут А.А., научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН, Республика Башкортостан СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИНТРОДУКЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА OENOTHERA L. В РЕСПУБЛИКЕ...»

«Камчатский филиал Тихоокеанского института географии (KФ ТИГ) ДВО РАН Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО) Биология Численность Промысел Петропавловск-Камчатский Издательство Камчатпресс 2009 ББК 28.693.32 Б90 УДК 338.24:330.15 В. Ф. Бугаев, А. В. Маслов, В. А. Дубынин. Озерновская нерка (биология, численность, промысел). Петропавловск-Камчатский : Изд-во Камчатпресс, 2009. – 156 с. В достаточно популярной форме представлены научные данные о...»

«Федеральное государственное бюджетное учреждение наук и Биологопочвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук (БПИ ДВО РАН) Совет молодых ученых БПИ ДВО РАН Дальневосточный федеральный университет (ДВФУ) Школа естественных наук I ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ Современные исследования в биологии 25 - 27 сентября 2012 г. г. Владивосток МОРФОГЕНЕЗ ДРЕВНЕЙШИХ ПРЕСНОВОДНЫХ МОЛЛЮСКОВ НАДСЕМЕЙСТВА VIVIPAROIDEA (GASTROPODA: ARCHITAENIOGLOSSA) Л.А. ПРОЗОРОВА1, В.В....»

«Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности Том II Ульяновск - 2013 Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности / - Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. II - 186 с. ISBN 978-5-905970-14-6 Редакционная коллегия: д.б.н., профессор Д.А. Васильев...»

«Уважаемые участники конференции! От имени Дальневосточного государственного технического рыбохозяйственного университета я рад приветствовать вас на очередной Международной научно-технической конференции Актуальные проблемы освоения биологических ресурсов Мирового океана. Я уверен, что в ходе работы мы сможем обсудить множество актуальных тем: совершенствование существующих технологий, нахождение путей оптимизации эксплуатации биоресурсов, исчезновение некоторых видов рыб, а также многие другие...»

«алтайский государственный университет Ботанический институт им. в.л. комарова ран Центральный сиБирский Ботанический сад со ран алтайское отделение русского Ботанического оБЩества Проблемы ботаники Южной сибири и монголии Сборник научных статей по материалам Деcятой международной научно-практической конференции (Барнаул, 24–27 октября 2011 г.) Барнаул – 2011 уДК 58 П 78 Проблемы ботаники Южной сибири и монголии: сборник научных статей по материалам X международной научно-практической...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/12/10 23 July 2014 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Двенадцатое совещание Пхёнчхан, Республика Корея, 6-17 октября 2014 года Пункт 12 предварительной повестки дня* ОБНОВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРЕСМОТРА/ОБНОВЛЕНИЯ И ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТРАТЕГИЙ И ПЛАНОВ ДЕЙСТВИЙ ПО СОХРАНЕНИЮ БИОРАЗНООБРАЗИЯ, ВКЛЮЧАЯ НАЦИОНАЛЬНЫЕ ЦЕЛЕВЫЕ ЗАДАЧИ, И ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ПЯТЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ ДОКЛАДОВ Записка Исполнительного секретаря**...»

«Ukraine, Russia, Kazakhstan and Turkmenistan, shows its relationship with the 11-year cycle of solar activity, when it peaks occur during periods of sharp increase or decrease in solar activity near the maximum, and minimum - for periods of low solar activity ( fig.) Among the countries of Eastern and Western Europe is characterized by similar dynamics only for Romania. For other countries the situation is not so clear, it is associated with dominance or high-frequency oscillation periods of...»

«114 XIX ЕЖЕГОДНАЯ БОГОСЛОВСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ В центре рассказа находится небожитель — кроткий мальчик, которому естественно присуща доброта, который не способен ко злу. Но одновременно он оказывается неспособным и жить на грешной земле и увядает, как цветок на чужеродной почве. Художественная мысль Готорна не могла не ощущать неполноценность такого добра. Развитие таланта писателя со временем привело его к изображению добра, которое является плодом сознательного и выстраданного выбора, плодом...»

«В защиту наук и Бюллетень № 8 67 Королва Н.Е. Ботаническую науку – под патронаж РПЦ? (по поводу статьи члена-корреспондента РАН, д.б.н. В.К. Жирова Человек и биологическое разнообразие: православный взгляд на проблему взаимоотношений)119 1. Проблема Проблемы взаимодействия власти и религии, науки и религии, образования и религии требуют современного переосмысления и анализа. Возможен ли синтез научного и религиозного знания, и не вредит ли он науке и научной деятельности, и собственно,...»

«Институт биологии Коми НЦ УрО РАН РЕГИСТРАЦИОННАЯ ФОРМА КЛЮЧЕВЫЕ ДАТЫ Коми отделение РБО Заявка на участие и тезисы докладов в электронном виде 1.02.2013 Министерство природных ресурсов и охраны Фамилия Второе информационное письмо 1.03.2013 окружающей среды Республики Коми Оплата оргвзноса 15.04.2013 Имя Управление Росприроднадзора по Республике Коми Регистрация участников Отчество и открытие конференции 3.06. ФИО соавтора (соавторов) Представление материалов БИОРАЗНООБРАЗИЕ ЭКОСИСТЕМ для...»

«Федеральное государственное бюджетное учреждение наук и ИНСТИТУТ ВОДНЫХ И ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБЛЕМ Дальневосточного отделения РАН Российская конференция с международным участием РЕГИОНЫ НОВОГО ОСВОЕНИЯ: ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ИЗУЧЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО И ЛАНДШАФТНОГО РАЗНООБРАЗИЯ 15-18 октября 2012 г. г. Хабаровск Сборник докладов УДК 502.7:582(571.6); 591(571.62) Конференция с международным участием Регионы нового освоения: теоретические и практические вопросы изучения и...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/3 РАЗНООБРАЗИИ 19 December 2005 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20-31 марта 2006 года Пункт 9 предварительной повестки дня* ДОКЛАД О РАБОТЕ ОДИННАДЦАТОГО СОВЕЩАНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ОРГАНА ПО НАУЧНЫМ, ТЕХНИЧЕСКИМ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ КОНСУЛЬТАЦИЯМ СОДЕРЖАНИЕ Страница ПУНКТ 1 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ ПУНКТ 2 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ...»

«Совет Европы Министерство природных ресурсов и экологии Российской Федерации Учреждение Российской академии наук Институт географии РАН Балтийский фонд природы Национальный парк Валдайский Российский Фонд Фундаментальных Исследований ГЕОГРАФИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СЕТЕЙ В РОССИИ И ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЕ Материалы электронной конференции (1-28 февраля 2011 г.) Товарищество научных изданий КМК Москва 2011 УДК 502.4-574.4 (924.7-470) Географические основы формирования экологических...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ КОНВЕНЦИЯ ПО БОРЬБЕ Distr. GENERAL С ОПУСТЫНИВАНИЕМ ICCD/COP(7)/13 4 August 2005 RUSSIAN Original: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН Седьмая сессия Найроби, 17-28 октября 2005 года Пункт 15 предварительной повестки дня ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ДОКЛАД О СОСТОЯНИИ РАБОТЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ПРОВЕДЕНИЮ В 2006 ГОДУ МЕЖДУНАРОДНОГО ГОДА ПУСТЫНЬ И ОПУСТЫНИВАНИЯ Записка секретариата РЕЗЮМЕ На своей очередной пятьдесят восьмой сессии Генеральная Ассамблея Организации 1. Объединенных Наций,...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.