WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:   || 2 |

«ISSN 2077- 6055 КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ ВЫПУСК 28 CАНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2012 -2УДК 576.3, 576.4, 576.5, 576.8.097, М-54 ISSN 2077- 6055 Клеточные культуры. Информационный ...»

-- [ Страница 1 ] --

АССОЦИАЦИЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ПО КЛЕТОЧНЫМ КУЛЬТУРАМ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ISSN 2077- 6055

КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ

ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ

ВЫПУСК 28

CАНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2012

-2УДК 576.3, 576.4, 576.5, 576.8.097, М-54 ISSN 2077- 6055 Клеточные культуры. Информационный бюллетень. Выпуск 28.

Отв. ред. М.С. Богданова. - СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2012. - 62 с.

Настоящий выпуск содержит информацию об основных направлениях фундаментальных и прикладных исследований на клеточных культурах, о новых методах, о научных совещаниях, школах и конференциях.

Сборник «Клеточные культуры» (информационный бюллетень) предназначен для широкого круга исследователей, работающих в области клеточной биологии, биотехнологии, вирусологии и медицины.

Полная электронная версия настоящего выпуска помещена на сайте Института цитологии РАН (Санкт-Петербург): http://www.cytspb.rssi.ru Составитель и ответственный редактор: М.С. Богданова Редакционная коллегия: Г.П. Пинаев М.С. Богданова Г.Г. Полянская © Авторы статей, указанные в тексте, © Составление. Ассоциация специалистов по клеточным культурам, Институт цитологии РАН,

-3СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ: ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ

КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

ВЛИЯНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ

НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИМФОБЛАСТОИДНОЙ ЛИНИИ NAMALVA

О.А. Шашкова, М.П.* Самойлович, А.А. Пиневич, Н.Л. Вартанян, В.Б. Климович ФБГУ РНЦ радиологии и хирургических технологий, Санкт-Петербург, * mpsamoylovich@gmail.com Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) способны угнетать или стимулировать размножение трансформированных клеток в зависимости от гистогенеза последних, уровня их дифференцировки и/или условий культивирования. Задача работы состояла в изучении влияния МСК жировой ткани на пролиферацию лимфобластоидных клеток линии Namalva при разных условиях культивирования. Клетки того и другого типа культивировали в атмосфере с 5% СО2 и 20% О2 (нормоксия) или 5% О2 (гипоксия).

Дефицит ростовых факторов создавали за счет использования сыворотки со сниженной ростостимулирующей активностью. Гипоксия стимулировала пролиферацию клеток Namalva при выращивании в среде, богатой ростовыми факторами, и оказывала подавляющий эффект при дефиците ростовых факторов. При сокультивировании клеток Namalva с МСК наблюдали образование тесных контактов между клетками обоих типов.

Совместное культивирование клеток Namalva с МСК в стандартной ростовой среде стимулировало пролиферацию лимфобластоидных клеток в нормоксии и при гипоксии.

В условиях дефицита сывороточных ростовых факторов сокультивирование с МСК обеспечивало выживание клеток Namalva как в нормоксии, так и при гипоксии, а также способствовало их пролиферации. Таким образом, МСК из жировой ткани обеспечивают выживание и пролиферацию трансформированных B-лимфобластоидных клеток линии Namalva в условиях дефицита ростовых факторов.

Ключевые слова: стволовые клетки, лимфобластоидные линии, сокультивирование.

Накопленные за последнее десятилетие сведения об иммуномодулирующей активности мезенхимальных стволовых (стромальных) клеток (МСК) (1, 2, 3) дали основания предполагать, что в перспективе МСК могут заменить лекарственную -4иммунодепрессию при профилактике проявлений тканевой несовместимости, лечении воспалительных, аутоиммунных и аллергических заболеваний. К настоящему времени, однако, активность МСК как биологических иммуномодуляторов изучена лишь в общих чертах. Остается неясным вопрос о влиянии МСК на функции В-лимфоцитов и на процесс превращения их в плазматические клетки-продуценты антител. Опубликованы данные об ингибирующем действии МСК на пролиферацию В-лимфоцитов и на синтез антител (4, 5). В других исследованиях показано, что присутствие МСК усиливает процессы размножения и дифференцировки В-лимфоцитов (6, 7, 8). Противоречия могут быть обусловлены как особенностями изучаемых объектов, так и различиями в условиях их культивирования. Во всех указанных работах источником МСК служили клетки костного мозга. Наряду с В-лимфоцитами донорской крови использовали клетки селезенки человека и мыши. В работе Am-Thomas с соавторами (8) изучали действие МСК на В-клеточные линии. Применение лимфомных, лимфобластоидных и миеломных В-клеточных линий в качестве тест-объектов модулирующего действия МСК имеет ряд преимуществ. Такие линии стабильны, сохраняют основной дифференцировочный признак (способность синтезировать иммуноглобулины) и в отличие от монослойных культур МСК представляют собой суспензионные культуры. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния МСК, полученных из жировой ткани человека, на пролиферацию клеток лимфобластоидной линии Namalva в зависимости от условий культивирования.

Образцы подкожной жировой ткани были получены при информированном согласии от двух пациентов в ходе выполнения плановых хирургических операций по поводу злокачественных новообразований и от двух здоровых доноров. Согласно стандартной процедуре выделения МСК (9) ткань механически измельчали и выдерживали в 0,1% растворе коллагеназы (Sigma), приготовленном на среде -MEM с 10 mM HEPES.



Диссоциированные клетки отмывали от фермента с помощью центрифугирования и рассевали в вентилируемые культуральные флаконы при плотности 100–400 тыс. клеток на 1 см2 (кл/см2). Через 24 часа заменяли среду, удаляли неприкрепившиеся ко дну клетки. Монослой прикрепившихся клеток по достижении 70-80% конфлюента пересевали при плотности 5 тыс. кл/см2. В экспериментах использовали клетки 3- антител против CD34, HLA-DR, CD29, CD44, CD90, CD105, CD73 на проточном цитофлуориметре BD FACSCaliburTM (Becton-Dickinson) в соответствии с инструкцией производителя.

Линию лимфобластоидных клеток Namalva, полученную из Коллекции клеточных культур ИНЦ РАН, выращивали в среде DMEM/F12 с добавлением 5% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone Defined). Для приготовления стандартной ростовой среды использовали сыворотку, хранившуюся при +40С не более 3 мес. Для приготовления среды, дефицитной по ростовым факторам, использовали сыворотку того же происхождения, хранившуюся при +40С в течение 12 мес. Все культуры выращивали в мультигазовом инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% CO2 и 20%О2 (условия нормоксии) или 5% CO2 и 5%О2 (гипоксия).

Влияние МСК на клетки Namalva исследовали с помощью метода контактного сокультивирования. МСК рассевали в ячейки 24-луночного планшета по 5 тыс кл/см2..

После прикрепления и распластывания МСК занимали 15-20% поверхности ячеек. Через сутки в те же ячейки вносили клетки Namalva в дозах 5, 10 или 50 тыс кл/мл. Контролем служили клетки Namalva, культивируемые без МСК. На 5 сутки после посева численность клеток в культурах определяли с помощью кондуктометрического счетчика Z1 (Beckman-Coulter). Счетчик был откалиброван для дифференцированного учета лимфобластоидных (меньших по размеру) и мезенхимальных (более крупных) клеток.

Коэффициент размножения лимфобластоидных клеток вычисляли как отношение N5/N0, где N0 – посевная доза клеток, а N5 - количество клеток в культуре на 5 сутки. Все эксперименты были поставлены в 3–6 повторностях. На гистограммах представлены средние арифметические значения.

При посеве клеток Namalva в дозах от 5 до 50 тыс. кл/мл в стандартной ростовой среде в условиях нормоксии наблюдали прямую зависимость величины коэффициента размножения от посевной дозы (рис 1). При дозе 2 тыс. кл/ мл за 5 суток культивирования численность клеток не нарастала, а при дальнейшем снижении плотности происходила гибель культур. Эти результаты определили выбор диапазона посевных концентраций клеток Namalva в последующих опытах.

клеток Namalva наблюдали только в случае, если плотность посева превышала 10 тыс.

кл/мл (рис. 1).

Рис.1. Влияние дефицита ростовых факторов на коэффициент размножения клеток Namalva при культивировании в условиях нормоксии. 1- стандартная культуральная среда; 2- среда, дефицитная по ростовым факторам.

Снижение концентрации O2 до 5% при культивировании клеток в стандартной ростовой среде стимулировало их пролиферацию. Прирост численности клеток в условиях гипоксии был в 1,3-1,9 раза больше, чем при нормоксии. Стимулирующий эффект гипоксии проявлялся только при выращивании клеток в среде, содержащей сыворотку, богатую ростовыми факторами. При использовании среды, дефицитной по ростовым факторам, и посевной дозе ниже 10 тыс. кл/мл гипоксия приводила к снижению плотности культуры и е гибели (рис. 2).

Рис.2. Влияние гипоксии и дефицита ростовых факторов на коэффициент размножения клеток Namalva. 1- культивирование в стандартной среде при нормоксии (контроль); 2стандартная среда + гипоксия, 3- среда, дефицитная по ростовым факторам + гипоксия.

по экспрессии поверхностных маркеров (табл.1). Культуры МСК, обозначенные номерами 7 и 11, происходили из липоаспиратов здоровых доноров. Образцы культур МСК под номерами 6 и 8 были выделены из жировой ткани, иссеченной в ходе удаления злокачественных новообразований. Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что по экспрессии основных маркеров культивируемые МСК пациентов не отличались от клеток доноров.

Таблица 1. Экспрессия поверхностных маркеров на МСК жировой ткани, использованных в опытах по сокультивированию с клетками Namalva.

Антиген Процент клеток, экспрессирующих антиген в культурах МСК При сокультивировании с МСК в течение первых суток после посева клетки Namalva оседали на дно ячеек, концентрировались вокруг МСК и прикреплялись к ним настолько плотно, что при осторожном перемешивании содержимого ячеек на орбитальном шейкере не переходили в суспензию. Если посевная доза составляла 50 тыс. кл/мл, лимфобластоидные клетки полностью маскировали распластанные МСК, оставляя свободной только поверхность, не покрытую монослойной культурой. На протяжении последующих дней пролиферирующие клетки формировали на поверхности МСК трехмерные колонии. По мере роста колоний часть клеток Namalva переходила в суспензию. На 5 сутки сокультивирования пипетирование позволяло перевести в суспензию незначительную часть лимфобластоидных клеток. Для полного перевода в суспензию лимфобластоидных клеток в ячейки наливали стандартный раствор трипсина (фирмы Биолот) и инкубировали при комнатной температуре под контролем инвертированного микроскопа. При этом наряду с клетками Namalva с поверхности удаляли часть МСК. Ферментативную активность трипсина ингибировали, перенося клеточную суспензию в среду DMEM с добавлением 10% сыворотки. Суспензии, количества клеток.

Сокультивирование клеток Namalva с МСК в стандартной ростовой среде в условиях нормоксии стимулировало пролиферацию лимфобластоидных клеток. Коэффициент размножения в смешанной культуре увеличивался при всех посевных дозах, эффект был наиболее значим при минимальной из использованных доз (рис. 3).





Рис. 3. Влияние МСК на пролиферацию клеток Namalva в стандартной ростовой среде в условиях нормоксии или гипоксии. 1- культура Namalva при нормоксии; 2сокультивирование Namalva с МСК при нормоксии; 3-сокультивирование Namalva с МСК при гипоксии. Представлены средние значения, полученные для четырех культур МСК от разных индивидуумов.

В экспериментах были использованы две культуры МСК, полученные из липоаспиратов здоровых доноров и две культуры, выделенные из подкожной жировой клетчатки пациентов. Стимуляцию пролиферации клеток Namalva наблюдали при культивировании с МСК всех четырех культур.

Влияние МСК на клетки Namalva при культивировании в среде, бедной ростовыми факторами, было изучено как в условиях нормоксии, так и в атмосфере с пониженным содержанием кислорода.

Совместное культивирование с МСК частично компенсировало эффект дефицита ростовых факторов сыворотки и обеспечивало выживание лимфоидных клеток и их пролиферацию (рис. 4).

Как было показано выше, гипоксия угнетала пролиферацию клеток Namalva, культивируемых в среде, бедной ростовыми факторами. Присутствие МСК в такой среде компенсировало негативный эффект гипоксии (рис. 5).

Постоянные линии, происходящие из В-лимфоцитов человека, в течение нескольких десятилетий используются как экспериментальные модели при изучении биологии Влимфоцитов, процессов их злокачественной трансформации и механизмов синтеза иммуноглобулинов (10, 11, 12).

Рис.4. Влияние МСК на пролиферацию клеток Namalva при нормоксии в среде, дефицитной по ростовым факторам. 1- культура Namalva; 2-сокультивирование Namalva с МСК.

Рис.5. Влияние МСК на пролиферацию клеток Namalva при гипоксии в среде, дефицитной по ростовым факторам. 1- культура Namalva; 2-сокультивирование Namalva с МСК.

Известны единичные работы, в которых изучали влияние МСК на лимфомные или лимфобластоидные клетки В-клеточных линий (8, 13). Многообразие таких линий, иммортализованных на разных стадиях дифференцировки, заставляет уделять серьезное внимание оптимизации условий культивирования. Полученные в настоящей от плотности посева и от ростовых факторов сыворотки. В ходе настоящей работы установлено, что сильное стимулирующее действие оказывает снижение концентрации кислорода до 5%, что ранее не было известно и во многих прежних исследованиях не учитывалось.

Наибольшую стимуляцию пролиферации клеток Namalva наблюдали при сочетании богатой ростовыми факторами (стандартной) культуральной среды и гипоксии. В этих условиях практически нивелировалась зависимость скорости размножения от плотности посева. Важно подчеркнуть, что гипоксия оказывала положительное влияние только при наличии полноценной ростовой среды. При использовании среды, дефицитной по ростовым факторам, в условиях гипоксии клетки Namalva либо практически не размножались, либо погибали.

Присутствие монослоя МСК стимулировало пролиферацию клеток Namalva.

Коэффициент размножения был наибольшим при сокультивировании на полноценной ростовой среде в условиях гипоксии. В среде, дефицитной по ростовыми факторам, гипоксия угнетала пролиферацию клеток Namalva. Присутствие МСК в такой среде компенсировало ингибирующий эффект гипоксии. Таким образом, в целом полученные результаты позволяют сделать вывод о стимулирующем действии МСК на клетки линии Namalva. При этом активность МСК, выделенных от пациентов с новообразованиями, была такой же, какую проявляли клетки здоровых доноров.

В настоящей работе получены данные об установлении тесных контактов между МСК и лимфобластоидными клетками Namalva. Эти наблюдения дополняют опубликованные ранее сообщения о контактном взаимодействии МСК с кардиомиоцитами (14) или Тлимфоцитами (15) и позволяют думать, что выявляемая при сокультивировании склонность МСК к установлению тесных контактов с клетками разных линий дифференцировки представляет собой универсальное свойство, которое может проявляться и в условиях целостного организма.

1. Uccelli A., Moretta L., Pistoia V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells. Eur J Immunol., 2006, 36: 2566-2573.

стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2006, 1 (3): 36-41.

3. Shi M., Liu Z.W., Wang F.S.. Immunomodulatory properties and therapeutic application of mesenchymal stem cells. Clin Exp Immunol., 2011, 164:1-8.

4. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E., Giunti D., Cappiello V., Cazzanti F., Risso M., Gualandi F., Mancardi G.L., Pistoia V., Uccelli A. Human mesenchymal stem cells modulate Bcell functions. Blood 2006, 107: 367–372.

5. Schena F., Gambini C., Gregorio A., Mosconi M., Reverberi D., Gattorno M., Casazza S., Uccelli A., Moretta L., Martini A., Traggiai E. Interferon--dependent inhibition of B cell activation by bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a murine model of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2010, 62: 2776-2786.

6. Traggiai E., Volpi S., Schena F., Gattorno M., Ferlito F., Moretta L., Martini A. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells induce both polyclonal expansion and differentiation of B cells isolated from healthy donors and systemic lupus erythematosus patients. Stem Cells. 2008, 26:

562-569.

7. Rasmusson I., Le Blanc K., Sundberg B., Ringden O. Mesenchymal stem cells stimulate antibody secretion in human B cells. Scand. J. Immunol. 2007. 65: 336–343.

8. Am-Thomas P., Maby-E.l. Hajjami H., Monvoisin C., Jean R., Monnier D., CauletMaugendre S., Guillaudeux T., Lamy.T., Fest T., Tarte K. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis. Blood. 2007, 109: 693-702.

9. Zuk, P.A. P.A., Zhu, M., Mizuno, H., Huang, J.I., Futrell, W.J., Katz, A.J., Benhaim, P., Lorenz, H.P., and Hedrick, M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cellbased therapies. Tissue Eng. 2001. 7: 211–226.

10. Sie L, Loong S., Tan E.K. Utility of lymphoblastoid cell lines. J. Neurosci. Res. 2009, 87:1953-1959.

11. Самойлович М.П., Пиневич А.А., Вартанян Н.Л., Климович В.Б. Продукция IgM и Jцепи В-лимфобластоидными клеточными линиями. Клеточные культуры. Инф. бюллетень.

2010, вып. 25: 15-23.

12. Ballow M., Wang W., Xiang S. Modulation of B-cell immunoglobulin synthesis by retinoic acid.

Clin. Immunol. Immunopathol. 1996, 80: 73-81.

13. Bocelli-Tyndall C., Bracci L., Spagnoli G., Braccini A., Bouchenaki M., Ceredig R.

Pistoia V., Martin I., Tyndall A. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) from healthy donors and auto-immune disease patients reduce the proliferation of autologous- and allogeneicstimulated lymphocytes in vitro. Rheumatology. 2007, 46: 403-408.

14. Plotnikov E.Y.,, Khryapenkova T.G., Vasileva A.K., Marey M.V., Galkina S.I., Isaev N.K., Sheval E.V., Polyakov V.Y., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J. Cell Mol. Med. 2008, 12:1622-1631.

15. Suva D., Passweg J., Arnaudeau S., Hoffmeyer P., Kindler V. In vitro activated human T lymphocytes very efficiently attach to allogenic multipotent mesenchymal stromal cells and transmigrate under them. J. Cell Physiol. 2008, 214: 588-594.

- 12 ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ

ЖИРОВОЙ ТКАНИ В ВОССТАНОВИТЕЛЬНОМ ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЦНС

Государственное учреждение Институт нейрохирургии им. акад. А.П.Ромоданова АМН В обзоре литературы обобщены современные представления о биологических свойствах мезенхимальных стволовых клеток (МСК) взрослого организма. Особое внимание уделено особенностям получения и культивирования плюрипотентных аутологичных МСК стромальноваскулярной фракции жировой ткани (СКЖТ). Рассмотрены методы направленной нейрогенной дифференцировки СКЖТ и перспективы их использования в восстановительном лечении ряда заболеваний ЦНС. Освещены возможные нежелательные последствия и опасности неконтролируемой спонтанной дифференцировки МСК в разнородные клеточные линии.

Ключевые слова: стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, жировая ткань, нейрогенная дифференцировка, культивирование клеток, заболевания ЦНС.

Современное состояние учения о биологии мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из различных тканевых источников взрослого человека позволяет надеяться на возможность их использования как объекта тканевой терапии в восстановительном лечении ряда заболеваний ЦНС - нейродегенеративных, ишемических, травматических, наследственных и др. Показана высокая выживаемость с признаками нейрогенной дифференцировки предварительно культивированных МСК из жировой ткани (ЖТ) человека при аллотрансплантации в ЦНС иммунодефицитных мышей и крыс, а также при ауто- и аллотрансплантации от человека к человеку при введении клеток в мозг гистосовместимых пациентов с цереброваскулярным инсультом, болезнью Паркинсона, болезнью Альцеймера (1). Установлено, что благодаря паракринной функции МСК позитивно влияют на состояние больных при некоторых видах патологии нервной системы. Это подтверждается экспрессией нейрогенина 1 (Ngn1) и пронейрального гена, которые преобразуют мезодермальный путь развития МСК в нейрогенный (2).

Восстановительная функция МСК объясняется их плюрипотентностью, способностью к общим свойствам МСК относят их высокий пролиферативный потенциал и способность к симметричному и асимметричному делению. При этом терапевтический системэффект трансплантации МСК, наблюдаемый в ряде доклинических и клинических испытаний, определяется не только дифференцировкой, но и регуляторной функцией этих клеток (3, 4).

Так как МСК способны подавлять иммунореактивность, их клиническое применение приобретает особо важное значение при ряде аутоиммунных заболеваний (красная волчанка, рассеянный склероз), а также при трансплантации органов и тканей. Сходные механизмы течения этих процессов и реакции «трансплантат против хозяина» позволяют предположить, что трансплантация МСК может затормозить развитие этих заболеваний (4).

В настоящее время особенно активно обсуждается возможность использования для клеточной терапии плюрипотентных аутологических СК стромально-васкулярной фракции жировой ткани (СКЖТ), содержащей малодифференцированные клетки-предшественники в соединительнотканных междольковых перегородках. Первостепенным преимуществом СКЖТ является доступность получения ЖТ в достаточном объеме практически для любого пациента, а также относительно несложные ферментативные процедуры их обработки для культивирования. В связи с этим ЖТ рассматривается как оптимальный ресурс для клеточной терапии, в том числе, и для регенерации поврежденной нервной ткани. Предполагается, что ЖТ может явиться альтернативным источником аутологичных СК, которые можно получать малоинвазивным способом в необходимых количествах под местной анестезией, неоднократно, с минимальными неудобствами для пациента при низкой контаминированности другими видами клеток (35).

Так как механизмы восстановительного влияния МСК из ЖТ включают эффекты, связанные с их секреторной активностью, они могут принимать участие в репаративных процессах в организме, в восстановлении поврежденной сосудистой сети, а также в регуляции иммунных процессов, что значительно повышает восстановительный эффект клеточной терапии при их использовании (5, 6).

Как известно, ЖТ взрослого человека имеет сложный клеточный состав и содержит зрелые адипоциты, преадипоциты, фибробласты, гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки, моноциты, макрофаги и Т-лимфоциты. Стромально-васкулярная фракция клеток ЖТ (СКЖТ) это клетки, полученные сразу после их выделения из ЖТ ферментативным путем с помощью коллагеназы. При многих пассажах эти клетки поддерживают свои характеристики, использованием мультипанели мезенхимальных маркеров дифференцировки (табл. 1).

Согласно рекомендациям Международного общества по применению технологий работы с ЖТ, МСК, выделенные из ЖТ, определяются как «стволовые клетки жировой ткани» (AdiposeDerived Stem Cells – ASCs). В табл. 1 представлен молекулярный фенотип СКЖТ (цитировано по Shaffler A., Buchler Ch., 2007 (7).

СКЖТ-позитивные клеточные маркеры СКЖТ-негативные клеточные маркеры

HLA I HLA II

Фибронектин Эндомуцин ASMA (-актинин, специфичный для гладких мышц) Виментин Коллаген- Понимание общего профиля экспрессии генов и белков в СКЖТ является первостепенным следовательно, и для высокоэффективной клеточной терапии. СКЖТ на своей поверхности могут экспрессировать перечисленные выше клеточные маркеры. Приведенная информация обобщена по данным литературы, причем экспрессия поверхностных маркеров изучалась не на «первичных» клетках, а на клетках, полученных in vitro.

До настоящего времени были неизвестны поверхностные маркеры, экспрессируемые СКЖТ, и их отличия от маркеров, экспрессируемых фибробластами. Считается, что МСК должны, как минимум, экспрессировать CD105, CD73, CD90 и должны быть лишены маркеров гемопоэтической линии: c-kit, CD14, CD116, CD34, CD79L, CD19, HLA-DR. При этом отсутствие экспрессии HLA-DR и иммуносупрессивные свойства СКЖТ делают их пригодными для аллогенной трансплантации без риска отторжения тканей. Кроме того, они не вызывают in vitro аллореактивность несовместимых лимфоцитов, тормозят смешанные лимфоцитарные реакции и пролиферативный ответ лимфоцитов на митогены. Это подтверждает мнение о том, что СКЖТ обладают такими же иммуносупрессивными свойствами, как и МСК из КМ, и могут быть их альтернативой (5, 7, 8, 9, 10).

При сравнительном анализе с помощью микроаналитических тестов характера экспрессии генов человеческих МСК, полученных из ЖТ, КМ, пуповинного канатика и нормальных фибробластов, обнаружено 25 генов (включая гены фибронектина, ЕСМ2, глипикана-4, ID1, NFIB, HOXA5 и HOXB6), которые сверхэкспрессировались в препаратах МСК по сравнению с фибробластами. Между тремя препаратами МСК не выявлены отличия при использовании панели с 22 поверхностными антигенами. Однако при сравнении СК из ЖТ и из КМ с МСК из пуповинного канатика обнаружено несколько сотен дифференцированно экспрессированных генных последовательностей (11).

В настоящее время разработаны оптимальные методы выделения, культивирования и дифференцировки МСК из КМ и ЖТ в остео-, адипо-, миохондрогенные и нейрональные линии. В эксперименте установлено, что на скорость пролиферации и способность СКЖТ к дифференцировке могут влиять возраст донора, тип ткани (белая или бурая ЖТ), область забора (подкожная или висцеральная ЖТ), вид хирургической манипуляции, а также условия культивирования: контакт с пластиком, плотность посева, состав питательной среды (12, 13, 14, 15). При этом скорость пролиферации СК из ЖТ и период удвоения клеточной популяции зависят от вида хирургической манипуляции при некоторых преимуществах резекции и тумесцентной липосакции в сравнении с ультразвуковой липосакцией (12). Однако De Ugarte того же пациента, не выявили различий в получении эффективного количества СК, в кинетике их роста, старения, способности к многорядной дифференцировке и эффективности трансдукции генов. Судя по всему, еще окончательно не определена единая комбинация методик обработки и получения СК, которая имела бы преимущества (13).

Показано, что способность к адгезии и пролиферации более выражена у СКЖТ, полученных от доноров более молодого возраста, хотя по мере старения организма способность этих клеток к дифференцировке не утрачивается (17). Обнаружено также, что выделенные СКЖТ могут сохраняться с помощью криометодов и рекультивироваться in vitro (18). В то же время, на выживаемость и способность к дифференцировке СКЖТ и изоляции разных подтипов клеток могут влиять различные по качеству коллагеназные препараты и разная скорость центрифугирования.

Установлено также, что скорость роста и продолжительность жизни СКЖТ можно повысить с помощью использования антиоксидантов (например, N-ацетил- L-цистеин, L-аскорбиновая кислота) и низкой концентрации кальция (19). Пролиферацию СКЖТ можно стимулировать сфингозилфосфорилхолином через активацию c-jun N-терминал киназы (JNK) (21), тромбоцитарным фактором роста через активацию JNK (22) и с помощью онкостатина М через активацию протеинкиназы JAK3/STAT1-пути, ассоциированной с микроканальцами (23).

Продолжительность жизни человеческих СКЖТ может быть увеличена сверхэкспрессией каталитической субъединицы гена человеческой теломеразы (24).

По данным Zaragosi L.E. и соавторов (25) СКЖТ осуществляют экспрессию аутокринного FGF-2 кольца, которое обеспечивает их способность к самообновлению in vitro. Поскольку ингибирование МЕК1 снижает клоногенный потенциал СК из ЖТ, не влияя на их способность к дифференцировке, ERK1/2 сигнальный путь, вероятно, принимает участие в FGF-2опосредованном самообновлении.

Представляет интерес способность СКЖТ продуцировать сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) (26), а фактор некроза опухоли-L может существенно увеличивать секрецию VEGF, HGF и IGF-1 СКЖТ за счет р38 митогенактивированного протеин-киназозависимого механизма. Предполагается, что дальнейшее углубление знаний о молекулярных механизмах, регулирующих пролиферацию СКЖТ, будет способствовать совершенствованию методов их Известно, что СКЖТ способны дифференцироваться в мезодермальные клетки:

адипоциты, фибробласты, миоциты, остеоциты и хондроциты путем рядоспецифической дифференцировки (27). В то же время накапливается все больше данных о способности СКЖТ дифференцироваться в нейроны, эндокринные клетки, гепатоциты, эндотелиоциты и кардиомиоциты. Таким образом, СКЖТ обладают перекрестно-ростковой пластичностью (7).

Клетки с нейроноподобной морфологией, полученные в результате направленной дифференцировки из СКЖТ, экспрессируют некоторые маркеры, в том числе нейронспецифичные белки NSE, NeuN и нестин, подтверждающие их нейрональный фенотип (9, 28). Как известно, нейрогенная дифференцировка СК различного генеза сопровождается повышением экспрессии специфических генов и появлением в них таких белков цитоскелета, как нестин (маркер ранних нейральных предшественников), нейрональная форма тубулина глиальный кислый фибриллярный белок GFAP (маркер астроцитарной глии), белок, взаимодействующий с микротрубочками MAP2, специфичная для нейронов энолаза Eno2 и некоторые другие маркеры нейрогенной дифференцировки. Индукция нейрогенной дифференцировки СКЖТ возможна также с помощью ретиноевой кислоты (29) и нейротрофических факторов (30).

Нейрогенные эффекты ретиноевой кислоты in vitro могут быть оценены и по экспрессии гена Wnt-13 (31), при этом она стимулирует образование функционально незрелых нейронов с недоразвитой сетью синапсов при отсутствии электровозбудимости их мембраны.

Прединкубация таких незрелых форм в кондиционированной среде после культивирования зрелых астроцитов завершала дифференцировку цитоплазматических тел нейронов и их медиаторную специализацию. Однако, несмотря на то, что полученные in vitro нейроны человека из ЭСК уже начали использоваться в клинических испытаниях, научная база рестрикционного созревания ЭСК в нейроны только формируется. Детали программы лабораторного нейрогенеза строго засекречены и приватизированы частными фирмами. Повидимому, от идеи «один сигнал - один фенотип» приходится отказаться. Известно лишь, что рестрикционное созревание любой соматической линии клеток находится под контролем множества сигналов (31). В табл.2 приведен схематичный протокол рациональной процедуры получения СК (7).

Хирургическая резекция Обычная липосакция В стерильных условиях фрагментация полученной жировой ткани Ферментативная обработка коллагеназой или эластазой (30мин при 37С, встряхивание) Специальные протоколы для каждой линии тканевой дифференцировки Полученные после липосакции или хирургического вмешательства образцы ЖТ подвергаются ферментативной обработке коллагеназой (9) или эластазой (5). Из суспензии отдельных клеток путем центрифугирования выделяется осадочная фракция клеток стромально-васкулярного фенотипа, состоящая в основном из CD34+ клеток с примесью CD45+ лейкоцитарных клеток и эритроцитов (10, 32). Примесь эритроцитов удаляется из осадочной фракции с помощью инкубации клеток в лизирующем эритроциты буфере, при последующем культивировании клеток стромально-васкулярного фенотипа элиминируются CD45+ лейкоцитарные клетки крови за счет их слабой адгезии к необработанному пластику. В зависимости от источника и методики выделения из 1 г ЖТ удается получить 10 5-106 клеток (5). Полученные клетки способны дифференцироваться в клетки с нейроноподобной нестин), подтверждающие их нейрональный фенотип (9, 28).

Описана также нейрональная дифференцировка азацитидином СК, полученных из липоаспирата человека (33). СК, полученные из жира мочки уха человека, также поддерживали способность к самообновлению и дифференцировке в разные клеточные линии в специфических условиях культивирования. Последующая инкубация in vitro человеческих СКЖТ в присутствии bFGF и форсколина вызывала их дифференцировку в нейроны и глию (34).

Anghileri E. и соавторы (35) исследовали потенциал нейрогенной дифференцировки СКЖТ человека по протоколу, который включал формирование нейросфер и последующее культивирование с мозговым нейротрофическим фактором (BDNF) в сочетании с ретиноевой иммуноцитохимические и электрофизиологические признаки начальной нейрогенной дифференцировки. Клетки приобрели удлиненную форму с протрузией двух или трех клеточных отростков, селективно экспрессировали нестин и нейронные молекулы (включая рецептор GABA и тироксин гидроксилазу) при отсутствии глиальных фенотипичных маркеров.

Лопатина Т.В. и соавторы (36) СКЖТ второго пассажа культивировали с различными агентами: изобутилметилксантином (Isobutylmethylxanthine, IBMX), b-меркаптоэтанолом, глияпроизводным нейротрофическим фактором (glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF), мозговым нейротрофическим фактором (brain-derived neurotrophic factor; BDNF), ретиноевой кислотой (retinoic acid, RA), 5-азацитидином, а также с сочетанием этих веществ.

Эффективность нейральной индукции оценена на основе повышения транскрипции маркерных генов нейральной дифференцировки: нестина, 3-тубулина, MAP2 и нейронспецифической энолазы (Eno2). Экспрессию маркерных белков нейральной дифференцировки тестировали с помощью вестерн-блот анализа. При добавлении в индуцирующую среду RA или BDNF в сочетании с 5-азацитидином и культивировании СКЖТ с этими индукторами в течение недели повышалось содержание мРНК и белка нестина, тубулина и Eno2. При трансплантации в головной мозг мыши индуцированных в нейроны мышиных СКЖТ увеличивалась продолжительность жизни этих клеток, а также наблюдалась их миграция из области введения в смежную ткань мозга реципиента. Авторы заключили, что воздействие на СКЖТ ретиноевой кислоты и BDNF в сочетании с 5-азацитидином повышает уровень транскрипции нейральных маркеров, а также жизнеспособность и интеграцию Описана также нейроноподобная дифференцировка человеческих МСК, полученных из КМ, ЖТ, селезенки и тимуса, индуцированная либо химическими факторами, либо кокультивированием со шванновскими клетками человека (37). В кондиционированной среде для нейрального дифференцирования большинство МСК из КМ, ЖТ, селезенки и тимуса приобретали фенотипические особенности клеток астроцитарно/нейронального и олигодендроглиального генеза, однако процесс был переходным и обратимым, поскольку МСК возвращались к первоначальной морфологии и фенотипу. Авторы предположили, что химические факторы являются главным стимулом для нейрального дифференцирования МСК, инициируя нестрогие специфические изменения. В отличие от этого, кокультивирование МСК различного гистогенгеза со шванновскими клетками приводило к длительной, более устойчивой дифференцировке в шванновские клетки с экспрессией белков миелина на протяжении 12 дней. Авторы считают, что эти результаты могут иметь большое значение в разработке терапевтических подходов к лечению хронических нейропатий.

Wilkison W.O. и Gimble J.M. (1) предложен многостадийный способ получения предназначенной для трансплантации популяции СКЖТ, индуцированных к нейральной дифференцировке ретиноевой кислотой в сочетании с нейротрофическим фактором BDNF (35). Способ предусматривает культивирование популяции стромальных СКЖТ человека в стандартных условиях в течение 3-5 недель, затем 2-х этапную индукцию нейральной дифференцировки: в течение 3 дней культивирование клеток в бессывороточной среде с наличием bFGF (20нг/мл) и hEGF (20нг/мл), что приводит к образованию нейросфер, и затем в течение 30 дней - в присутствии 10 нг/мл BDNF и 0,75 мМ ретиноевой кислоты (RA).

Недостатками способа являются его длительность и недостаточная эффективность, т.к.

морфологические и иммуноцитохимические признаки нейральной дифференцировки проявляются примерно у половины клеток.

Способ Парфеновой Е.В. и соавторов (38) позволяет повысить этот показатель путем увеличения суммарной популяции из ЖТ TrkB-позитивных клеток, чувствительных к воздействию индукторов нейральной дифференцировки. Выделение субпопуляции TrkBпозитивных клеток в культуре осуществлялось с помощью иммуномагнитной селекции или иммуносортинга с использованием антител против рецептора TrkB, а последующая индукция нейральной дифференцировки обеспечивалась нейротрофическим фактором BDNF или ретиноевой кислотой в сочетании с 5-азацитидином. Этот способ повышает выход клеток с культуры к трансплантации.

В настоящее время активно обсуждается вопрос о применении МСК, полученных из ЖТ, для лечения расстройств нервной системы, повреждений спинного мозга, а также возрастных нейродегенеративных заболеваний ЦНС и др. (35, 39, 40). Использование МСК из ЖТ с предварительной дифференцировкой в нейральном направлении in vitro и их дальнейшая алло- или аутотрансплантация гистосовместимым пациентам считается перспективным при деструкции межпозвонковых дисков, при рассеянном склерозе, травмах спинного мозга, дегенеративных изменениях периферических нервов, болезни Хангтинтона, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, деменции, глиобластоме, нейробластоме, ДЦП, реакции «трансплантат против хозяина» и ряде других заболеваний (1, 41).

Введение СКЖТ человека в боковой желудочек мозга крыс через сутки после инсульта заметно улучшало поведенческие функций животных уже на 7 сутки. Это сопровождалось миграцией имплантированных клеток в различные области мозга и их выживание в течение не менее 30 дней (33). Это отражает тропность СКЖТ к очагу поражения в мозге.

Изучается возможность дифференцировки СКЖТ в олигодендроциты и шванновские клетки для дальнейшего их использования в лечении болезней периферической и центральной нервной системы. На модели повреждения спинного мозга крысы показано улучшение моторных функций после внутривенной трансплантации олигодендроцитарных клетокпредшественников, полученных из СКЖТ крысы. После 4-5 недель 30-35% имплантированных клеток-предшественников олигодендроцитов выжили, активно мигрировали в область травмы и были частично дифференцированы в нейроны и олигодендроциты (42).

дифференцироваться в фенотип шванновских клеток, которые можно было бы применять в лечении травматических повреждений периферических нервов (43).

Xu Y. и соавторы (44) индуцировали СКЖТ крысы в нейросферы с дальнейшей дифференцировкой в нейронально- и глиальноподобные клетки, а также в шванноподобные клетки с характерными морфологическими и иммуноцитохимическими признаками. Они обнаружили также способность шванноподобных клеток эффективно индуцировать дифференцировку клеток нейробластомы SH-SY5Y предположительно за счет секреции растворимых веществ. Более того, эти клетки формировали in vitro миелиновые структуры нейритов клеток PC12. Это указывает на возможность использования полученных из СКЖТ Куликовым А.В. с соавторами (31) изучена способность СКЖТ восстанавливать нарушенные функции мозга крыс при хорее Хантингтона, индуцированной внутрибрюшинным введением 3-нитропропионовой кислоты. Этот нейротоксин вызывает стойкий окислительный стресс и гибель нейронов базальных ядер в мозге, что ведет к развитию когнитивных расстройств, сходных с клиникой хореи Хантингтона у человека. Одноразовое внутрижелудочковое введение таким животным суспензии активированных мультипотентных МСК, полученных из ЖТ человека, снижало выраженность неврологической симптоматики, улучшало активность животных с почти полным восстановлением утраченной способности к обучению. Это подтверждено морфологически – было выявлено восстановление формы нейронов хвостатого ядра головного мозга крыс. По мнению авторов, эффективное лечение клинических проявлений при хорее Хантингтона у человека возможно также с помощью СК, полученных из собственной ЖТ пациента (31).

Lee D.H. и соавторы (45), исходя из положения о тропности НСК и МСК к опухолям головного мозга, сравнили миграционные способности НСК человека и МСК, полученных из КМ, ЖТ и пуповинной крови человека. При оценке направленной миграции НСК и МСК к глиоме ствола мозга крыс (F98) in vivo и in vitro показано, что тропная миграционная способность МСК различного происхождения подобна таковой у генетически модифицированных НСК, проявляющих терапевтическую эффективность против глиом ствола мозга. Аналогичные данные сообщили Choi S.A. и соавт. (46).

В то же время, ряд авторов напоминают о необходимой осторожности в применении терапии СК, поскольку они могут спонтанно дифференцироваться в разнородные клеточные линии in vivo или нежелательные типы клеток в месте имплантации (47). Так, трансплантация недифференцированных МСК в пораженный миокард может приводить к дифференцировке значительной их части в фибробласты, что усугубляет формирование рубцовой ткани и значительно снижает благоприятный результат лечения (48).

Кроме того, при системном введении СК могут оседать не только в органе-мишени, но и в тканях внутренних органов и дифференцироваться в хондроциты, адипоциты, стромальные клетки КМ, а также могут приобретать фенотип нейронов и астроцитов (49). Kang S.K. и соавторы (42) сообщили, что при внутривенном введении клеток-предшественников олигодендроцитов, полученных из СКЖТ крыс при экспериментальном повреждении спинного мозга крысы, после 4-5 недель клетки, частично дифференцировавшиеся в нейроны и клеток-предшественников олигодендроцитов мигрировали в ткани почек, мозга, легкого и печени по ходу венозной системы.

Наряду с этим, взрослые мультипотентные прогениторные клетки могут вовлекаться в процесс ангиогенеза растущих опухолей. Существование феномена дедифференцирования взрослых СК при длительном культивировании с приобретением ими свойств ЭСК (50), риск накопления генетических мутаций вследствие манипуляций in vitro, а также склонность СК к формированию гибридных клеток вследствие fusion-феномена говорят о том, что такие клетки после трансплантации могут являться очагом генетической нестабильности и давать начало неконтролируемому клеточному росту (51).

Таким образом, в приведенном обзоре литературы отражены основные достижения исследований биологии МСК взрослого организма. В настоящее время эта сложная многоплановая проблема переживает этап накопления экспериментальных данных, требующих подтверждения и осмысления. Важно учитывать, что наряду с перспективами применения МСК в комплексном лечении заболеваний ЦНС, возможны нежелательные последствия использования клеточной терапии и опасность неконтролируемой спонтанной дифференцировки МСК в разнородные клеточные линии. Это обосновывает необходимость дальнейших поисков в разработке ряда нерешенных вопросов в биологии МСК.

1. Wilkison W.O., Gimble J.M. Adipose tissue-derived stromal cell that expresses characteristics of a neuronal cell. US Patent 7078230, Appl.N: 09/793173, 07/18/2006.

2. Kim S.S., Yoo S.W., Park T.S., Ahn S.C., Jeong H.S., Kim J.W., Chang D.Y., Cho K.G., Kim S.U., Huh Y., Lee J.E., Lee S.Y., Lee Y.D., Suh-Kim H. Neural induction with neurogenin1 increases the therapeutic effects of mesenchymal stem cells in the ischemic brain. Stem Cells. 2008, 26, 9: 2217-2228.

3. Кругляков П.В., Лохматова Е.А., Климович В.Б., Зарицкий А.Ю.

Мезенхимные стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2006, 3, 5: 36-41.

4. Космачва С.М., Волк М.В., Потапнев М.П. Стволовые клетки взрослых:

проблемы получения, дифференцировки in vitro, перспективы клинического применения. Медицинские новости. 2008, 9: 5-9.

5. Трактуев Д.О., Марч К.Л., Ткачук В.А., Парфенова Е.В. Стромальные клетки жировой ткани - мультипотентные клетки с терапевтическим потенциалом для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей. Кардиология. 2006,46: 53–63.

6. Рябцева Е.С., Кривенко С.И., Левин В.И., Луц Л.С., Белевцев М.В., Усс А.Л., Змачинский В.А. Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани: характеристика и аспекты использования при трансплантации гемопоэтических клеток. Известия НАН Беларуси. 2006,1: 81-87.

Basic and Clinical Implication for Novel Cell-Based Therapies. Stem.Cells. 2007, 25, 4: 818Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 2001, 7, 2: 211–228.

9. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002, 13: 4279–4295.

10. Rehman J., Traktuev D., Li J., Merfeld-Clauss S., Temm-Grove C.J., Bovenkerk J.E., Pell C.L., Johnstone B.H., Considine R.V., March K.L. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004, 109,10: 1292-1298.

11. Wagner, W., Wein, F., Seckinger, A., Frankhauser M., Wirkner U., Krause U., Blake J., Schwager C., Eckstein V., Ansorge W., Ho A. D. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue and umbilical cord blood.

Exp.Hematol. 2005, 33: 1402-1416.

12. Oedayrajsingh-Varma M., van Ham S., Knippenberg M. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 2006, 8: 166-177.

13. Smith P., Adams W.P., Lipschitz A.H. Autologus human fat grafting: Effect of harvesting and preparation techniques on adipocyte gragt survival. Plas.Reconstr.Surg.

2006, 117: 1836-1844.

14. Prunet-Marcassus B., Cousin B., Caton D. From heterogeneity to plasticity in adipose tissue: Site-specific differences. Exp.Cell.Res. 2006, 312: 727-736.

15. Peptan I.A., Hong L., Mao J.J. Comparison of osteogenic potentials of visceral and subcutaneous adipose-derived cells of rabbits. Plast.Reconstr.Surg. 2006, 15: 1462–1470.

16. De Ugarte D.A., Alfonso Z., Zuk P.A., Elbarbary A., Zhu M., Ashjian P., Benhaim P., Hedrick M.H., Fraser J.K. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters.

2003, 89: 267 – 270.

17. Shi Y.Y., Nacamuli R.P., Salim A. The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging, Plas.Reconct.Surg. 2005, 116: 1686 – 1696.

18. Pu L.L., Cui X., Fink B.F. Adipose aspirate as a source for human processed lipoaspirate after optimal cryopreservation. Plast.Reconstr.Surg. 2006, 117: 1845-1850.

19. Lin T.M., Tsai J.L., Lin S.D. Accelerated growth and prolonger lifespan of adipose tissue – derived human mesenchymal stem cells in a medium using reduced calcium and antioxidants. Stem Cells Dev. 2005, 14: P.92-102.

20. Chion M., Xu Y., Longaker M.T. Mitogenic and chondrogenic effects of fibroblast growth factor-2 in adipose-derived mesenchymal cells. Biochem.Biophys.Res.Commun.

2006, 343: 644-452.

21. Jeon E.S., Song H.Y., Kim M.R., Moon H.J., Bae Y.C., Jung J.S., Kim J.H.

Sphingosylphosphorylcholine induces proliferation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells via activation of JNK. The Journal of Lipid Research. 2006, 47: 653Kang Y.J., Jeon E.S., Song H.Y. Role of c-Jun N-terminal adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J.Cell.Biochem. 2005, 95: 1135-1145.

adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Int.J.Biochem.Cell.Biol. 2005, 37:.2357Jun E.S., Lee T.H., Cho H.H., Suh, S. Y. and Jung, J. S. Expression of telomerase extends longevity and enhances differentiation in human adipose tissue-derived stromal cells. Cell Physiol Biochem, 2004, 14,4-6: 261-268.

25. Zaragosi L.E., Ailhaud G., Dani C. Autocrine fibroblast growth factor 2 signaling is critical for self-renewal of human multipotent adipose-derived stem cells. Stem Cells. 2006, 24: 2412-2419.

26. Wang M., Crisostomo P., Herring C. Human progenitor cells from bone marrow or adipose tissue produce VEGF, HGF and IGF-1 in responcse to TNF by a p38 mitogem activated protein kinase dependent mechanism. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.

2006, 291: 880-884.

27. Lin Y., Chen X., Yan Z. Multilineage differentiation of adipose-derived stromal cells from GFP transgenic mice. Mol.Cell Biochem. 2006, 285: 69-78.

28. Fujimura, J., Ogawa R., Mizuno H., Fukunaga Y., Suzuki H Neural differentiation of Biochem.Biophys.Res.Commun. 2005, 333, 1: 116-121.

29. Безбородов Н.С., Криевиня Г.А., Бабрыкин Д.А. Ретиноиды: индукторы нейрогенной или адипогенной дифференцировки культуры костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) крысы. Цитология.

2008, 50, 9: 795.

30. Rivera, F.J., Sierralta W.D., Minguell J.J., Aigner L. Adult hippocampus derived soluble factors induce a neuronal-like phenotype in mesenchymal stem cells. Neurosci.Let.

2006 406, 1-2: 49-54.

31. Куликов А.В., Ржанинова А.А., Гольдштейн Д.В., Болдырев А.А Экспрессия NMDA-рецепторов в мультипотентных стромальных клетках жировой ткани человека в условиях дифференцировки, индуцированной ретиноевой кислотой. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2007, 4:.216-220.

32. Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. Andre M., Nibbelink M., Tamarat R.

Clergue M., Manneville C., Saillan-Barreau C., Duriez M., Tedgui A., Levy B., Pnicaud L., Casteilla L. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells:

physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 2004, 109: 656.

33. Kang S.K., Lee D.H., Bae Y.C., Kim H.K., Baik S.Y., Jung J.S. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats. Exp.Neurol. 2003, 183: 355-366.

34. Sujeong J., Hyong-Ho Ch., Yong-Bum Ch., Jong-Seong P., Han-Seong J.

Functional neural differentiation of human adipose tissue-derived stem cells using bFGF and forskolin. BMC Cell Biology. 2010, 11, 35. Anghileri, E., Marconi S., Pignatelli A., Cifelli P., Galie M., Sbarbati A., Krampera M., Belluzzi O., Bonetti B. Neuronal differentiation potential of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2008, 17: 909-916.

36. Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Ревищин А.В., Беме А.А., Спирова И.А., Павлова Г.В., Парфенова Е.В. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани. Клеточная трансплантология. 2008, III, 4: 50-54.

37. Krampera M, Marconi S, Pasini A, Gali M, Rigotti G, Mosna F, Tinelli M, Lovato L, Anghileri E, Andreini A, Pizzolo G, Sbarbati A, Bonetti B. Induction of neural-like thymus. Bone. 2007, 40, 2: 382-390.

38. Парфенова Е.В., Ткачук В.А., Рубина К.А., Калинина Н.И., Лопатина Т.В., Павлова Г.В., Ревищин А.В. Способ получения популяции стромальных клеток жировой ткани, индуцированных к нейральной дифференцировке. Патент на изобретение №2396345 RU, 15.12.2008.

39. Рябцева Е.С., Кривенко С.И., Левин В.И., Луц Л.С., Белевцев М.В., Усс А.Л., Змачинский В.А. Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани: характеристика и аспекты использования при трансплантации гемопоэтических клеток. Известия НАН Беларуси. 2006, 1: 81-87.

40. Hou L, Hong T. Stem cells and neurodegenerative diseases. Sci.China C.Life Sci.

2008, 51, 4: 287-294.

41. Wilkison W.O., Gimble J.M., Vanguri P. Adipose tissue derived stromal cells for the treatment of neurological disorders. US Patent 7582292, Appl.N: 11/286900, 09/01/2009.

42. Kang S.K., Shin M.J., Jung J.S., Kim Y.G., Kim C.H. Autologous adipose tissuederived stromal cells for treatment of spinal cord injury. Stem Cells Dev. 2006, 15, 4: 583Kingham P.J., Kalbermatten D.F., Mahay D., Armstrong S.J., Wiberg M., Terenghi G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp.Neurol. 2007, 207, 2: 267-274.

44. Xu Y., Liu Z., Liu L., Zhao C., Xiong F., Zhou C., Li Y., Shan Y., Peng F., Zhang C.

Neurospheres from rat adipose-derived stem cells could be induced into functional Schwann cell-like cells in vitro. BMC Neurosci. 2008, 12, 9:.21.

45. Lee D.H., Ahn Y., Kim S.U., Wang K.C., Cho B.K., Phi J.H., Park I.H., Black P.M., Carroll R.S., Lee J., Kim S.K. Targeting rat brainstem glioma using human neural stem cells and human mesenchymal stem cells. Clin.Cancer. Res. 2009, 15: 4925-4934.

46. Choi S.A., Hwang S.K., Wang K.C., Cho B.K., Phi J.H., Lee J.Y., Jung H.W., Lee D.H., Kim S.K. Therapeutic efficacy and safety of TRAIL-producing human adipose tissuederived mesenchymal stem cells against experimental brainstem glioma. Neuro.Oncol. 2011, 13, 1: 61-69.

47. Космачва С.М., Волк М.В., Потапнев М.П. Стволовые клетки взрослых:

проблемы получения, дифференцировки in vitro, перспективы клинического применения. Медицинские новости. 2008, 9: 5-9.

48. Yang S. E., Ha C. W., Jung M., Jin H. J., Lee M., Song H., Choi S., Oh, W., Yang Y.S. Mesenchymal stem/progenitor cells developed in cultures from UC blood. Cytotherapy.

2004, 6, 5: 476–486.

49. Gao J., Dennis J.E., Muzic R.F. Lundberg M., Caplan A.I. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 2001, 169: 12–20.

50. Orkin S.H., Morrison S.J. Biomedicine: stem-cell competition. Nature. 2002, 418:

25–27.

51. Dawson L., Bateman–House A.S., Mueller Agnew D. Bok H., Brock D.W., Chakravarti A., Greene M., King P.A., O'Brien S.J., Sachs D.H., Schill K.E., Siegel A., Solter D., Suter S.M. Safety issues in cell-based intervention trials. Fertil. Steril. 2003, 80:

1077–1085.

- 27 СТВОЛОВЫЕ И ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ ВЫСТИЛКИ ЧЕЛОВЕКА:

УСЛОВИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ, МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Н.Г. Антоневич 1, З.Б. Квачева 1, В.Л. Чекан 2, И.В. Сидоренко 2, Е.С. Лобанок Государственное учреждение «РНПЦ эпидемиологии и микробиологии»1, ГУО Белорусская государственная медицинская академия последипломного образования2, ГНУ «Институт Получение и культивирование стволовых и прогениторных клеток обонятельной выстилки (ОВ) человека является актуальным направлением для разработки протоколов лечения травматических и дегенеративных повреждений нервной системы. В настоящем исследовании оптимизированы условия выделения жизнеспособных клеток ОВ, обладающих высоким пролиферативным потенциалом, для приготовления гетерогенной первичной культуры. Охарактеризован морфофункциональный и фенотипический состав культивируемых клеток. Идентифицировано две популяции стволовых и прогениторных клеток ОВ.

Ключевые слова: обонятельная выстилка человека, культура клеток, эктомезенхимальные стволовые клетки, цитосферы.

Заместительная терапия поврежденных органов и тканей с использованием клеточных технологий - бурно развивающаяся область трансплантологии. Одним их многообещающих направлений в лечении травматических повреждений и дегенеративных заболеваний нервной системы является применение биопрепаратов на основе культивируемых нейральных стволовых и прогениторных клеток (НСПК) и их дифференцированных потомков (1). В настоящее время периферический отдел обонятельного анализатора, обонятельная выстилка (ОВ), рассматривается как перспективный источник НСПК (2, 3). Ткань ОВ состоит из двух слоев: нейроэпителия и подлежащей рыхлой соединительной ткани (lamina propria), которые представлены большим числом различных типов клеток, находящихся в сложных иерархичных взаимодействиях (4). ОВ содержит обонятельные рецепторные нейроны разной степени дифференцировки, глиальные обкладочные, эпителиальные, поддерживающие клетки и фибробласты (5). Рецепторные нейроны обонятельной области после завершения течение всей жизни. Постнатальный нейрогенез возможен благодаря присутствию в ткани ОВ пула цитокератин-5/6 позитивных стволовых клеток, располагающихся на базальной мембране нейроэпителия (5; 6, 7, 8, 9, 10; 11, 12). Показано, что при культивировании эти клетки формируют нейросферы, экспрессируют глиальные и нейрональные маркеры и способны к дифференцировке в клетки тканей других типов (13). Установлен положительный клинический эффект трансплантации культивируемых базальных стволовых и прогениторных клеток в сочетании с обкладочными глиальными (14; 15; 16) и фрагментов ткани обонятельной выстилки (17) у пациентов с травмами спинного мозга.

Недавно идентифицирована вторая популяция стволовых клеток ОВ мезенхимального происхождения, ниша которой находится в lamina propria (18). Показано, что клетки данной популяции обладают нейрогенным дифференцировочным потенциалом (18). При моделировании повреждений нервной системы у животных продемонстрировано положительное влияние их трансплантации на восстановление утраченных функций (19, 20).

Таким образом, стволовые и прогениторные клетки ОВ представляются достаточно перспективными кандидатами для использования в нейротрансплантологии.

В настоящее время приготовление культур клеток ОВ и накопление их биомассы, ввиду отсутствия единого протокола, представляет определенные сложности. Это частично связано с невозможностью стандартизировать условия получения биопсийного материала от доноров.

Существующие методики выделения и культивирования стволовых клеток не всегда воспроизводимы, недостаточно описан фенотипический состав и биология развития клеток ОВ в культуре. В связи с этим, целью исследования явилась оптимизация условий выделения и накопления биомассы стволовых и прогениторных клеток ОВ, обладающих высоким пролиферативным потенциалом, и изучение их фенотипических и морфофункциональных особенностей.

Источники ткани ОВ. Образцы ткани ОВ были получены из операционного материала области верхнего и среднего носового ходов, посылаемого на гистологическое исследование при проведении плановых хирургических вмешательств (БелМАПО, РНПЦ отолорингологии) у 12 пациентов с патологией носа и околоносовых пазух (искривление носовой перегородки).

Возраст пациентов 18-45 лет, мужчины и женщины. Площадь образцов - 5-25 мм2 (суммарно).

Образцы ткани транспортировали и хранили при +4 0С не более суток в питательной среде (10 мкг/мл) (Sigma).

Подготовка клеток для посева, приготовление первичных культур, субкультур. Ткань ОВ промывали в течение нескольких минут в фосфатном буфере, содержащем антибиотики.

Ткань механически измельчали на фрагменты размером 1-2 мм2, далее подвергали ферментативной обработке растворами 0,5% диспазы1 (Sigma), 0,5% коллагеназы панкреаса краба (Биолот), 0,05% трипсина (Gibco) и их сочетаниями в течение 30-90 мин. Для ткани размера 10 мм2 использовали 1 мл раствора ферментов. К дезагрерированной ткани добавляли 5-7 мл среды DMEM/F12, отмывали клетки от ферментов центрифугированием (~200g), резуспензировали в ростовой среде. Клетки культивировали в ростовой среде на основе DMEM/F12, с добавлением эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (HyClone), выращивали в пластиковых культуральных флаконах 12,5 см 2 (BD bioscience) в СО2-инкубаторе (5% СО2) при +37oС и влажности 95%. Смену среды осуществляли каждые 3дня. При пассировании культур клетки отделяли от поверхности флакона раствором 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА, пересевали в дозе 150-200 тыс/мл среды.

Фенотипирование клеток непрямым методом флуоресцирующих антител. В постановке непрямого метода флуоресценции использовали первичные моноклональные антитела в разведении 1:50-1:100 к: нестину; глиальному кислому фибриллярному белку (ГФКБ), цитокератину 18 (К18) (Stem Cell Technolоgies, Канада), фибронектину (Sigma, США);

вторичные антитела, разведение 1:100: козьи антикроличьи (AMCA) (Stem Cell Technolоgies, Канада); кроличьи антимышиные (FITC) (Sigma, США). На покровные стекла наносили 20 мкл суспензии клеток в фосфатном буферном растворе, фиксировали в смеси 4% раствором параформа – 30 мин при комнатной температуре. Стекла промывали фосфатным буферным раствором рН 7,2 (Sigma), просушивали, затем обрабатывали 0,3% раствором тритона Х-100 – 5 мин, снова промывали фосфатным буфером. Наносили первичные антитела, инкубировали 2 ч при 370С, затем после промывки антител, наносили вторичные антитела, инкубировали мин при 370С, промывали в фосфатном буфере. Клетки в опытных и контрольных препаратах исследовали под люминесцентным микроскопом (Nikon eclipse TS-1000, Япония).

Фенотипирование клеток с помощью метода проточной цитофлуориметрии. В постановке метода проточной цитофлуориметрии использовали антитела к: СD90(FITC), CD105(PE), CD45(PE-Cy7), CD34(APC) (Beckman Coulter), нестину (FITC) (RD system). Клетки в количестве 200-300 тыс. центрифугировали в фосфатном буфере (1000 об/мин) в течение определения экспрессии поверхностных молекул 50 мкл суспензии клеток смешивали с антителами и инкубировали 30 мин при 4°С. Отмывали несвязавшиеся антитела с помощью центрифугирования в форфатном буфере. Клетки резуспендировали в 400 мкл фосфатного буфера для анализа. Для определения экспрессии цитоплазматичеких маркеров клетки последовательно фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида (10 мин), пермеализировали в 0,1% растворе сапонина (15 мин), инкубировали с антителами 30 мин при 4°С. Отмывали несвязавшиеся антитела с помощью центрифугирования в фосфатном буфере, резуспендировали в 400 мкл фосфатного буфера. Флуоресценцию регистрировали на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur™ (BD Biosciences, США). При анализе проб выделяли регион по параметрам прямого и бокового светорассеяния, в котором анализировали не менее 10000 событий. Для анализа данных использовали программное обеспечение Weasel 3.0. (WEHI, Австралия).

Согласно данным литературы, способы накопления биомассы различных типов клеток ОВ имеют свои особенности в зависимости от поставленной на начальном этапе приготовления первичной культуры задачи: выделить популяции, обогащенные обкладочными глиальными, стволовыми и другими типами клеток, или получить гетерогенную по клеточному составу первичную культуру и при дальнейшем пассировании произвести избирательное накопление биомассы определенных типов клеток при создании селективных условий. Важным этапом получения первичной культуры является способ диссоциации исходной ткани на отдельные клетки. Данные литературы свидетельствуют о том, что для этого используют различные протеолитические ферменты и их смеси: коллагеназу, диспазу (13) раствор трипсина и ЭДТА в сочетании с дезоксирибонуклеазой (5) и др. Для повышения степени адгезии клеток различные авторы применяют флаконы, покрытые белками внеклеточного матрикса:

коллагеном, ламинином, фибронектином, полиаминокислотами (10, 13). Для последующего культивирования применяют разные по составу питательные среды на основе DMEM, DMEM/F12, альфа-MEM и др. с добавками: сывороткой крупного рогатого скота, ростовыми факторами (EGF, bFGF, NGF, LIF и др.), гормонами (инсулин, трийодтиронин). В наших исследованиях мы использовали среду DMEM/F12 богатую по составу (гормоны, микроэлементы и др.), обеспечивающую питательные потребности, жизнеспособность и высокую пролиферативную активность различных типов клеток.

клеток из биоптатов ОВ области средних и верхних носовых ходов человека без направленного выделения определенных типов клеток. С целью оптимизации условий выделения жизнеспособных клеток, имеющих высокий пролиферативный потенциал, были проведены сравнительные исследования диссоциации ткани с использованием следующих ферментов: диспазы 1, коллагеназы панкреаса краба, трипсина и их сочетаний. Установлено, что для диссоциации образцов ткани ОВ на отдельные клетки и их небольшие группы для последующего их прикрепления и пролиферации оптимальными являются условия ферментативной обработки механически измельченной ткани смесью диспазы 1 и коллагеназы панкреаса краба с конечной концентрацией 0,5% в течение 30 мин при 37°С с периодическим пипетированием. В условиях мягкой ферментативной обработки жизнеспособность клеток составляет 87±5%, при этом клетки и фрагменты ткани хорошо (65адгезируют к поверхности культурального флакона. Увеличение времени инкубации образцов более 30 мин (40-60 мин) приводит к снижению жизнеспособности клеток (71±7%.) Использование трипсина в концентрации 0,5% ведет к наиболее полной диссоциации ткани в течение 30 мин, однако снижает жизнеспособность клеток (63±8%) и их способность к прикреплению к поверхности флакона.

При первичном посеве клеток в количестве не менее 500 тыс в объеме 1 мл ростовой среды DMEM/F12 с добавлением 30% сыворотки адгезия клеток и эксплантатов происходила в течение 1-2 суток. Затем в течение 5 суток ежедневно добавляли свежую ростовую среду, содержащую 10% сыворотки, доводили объем до 5 мл. Данные условия обеспечили поддержание высокого пролиферативного потенциала клеток и образование монослоя, который формировался в течение 10- 14 суток.

Морфологический состав первичных культур ОВ был представлен следующими типами клеток: крупными эпителиоподобными клетками с маленьким ядром и одним-двумя ядрышками (рис.1, А), клетками небольших размеров полигональной формы с длинными ветвящимися отростками и крупным ядром, морфологически сходными с глиальными и фибробластоподобными, веретеновидными клетками (рис.1, Б).

В процессе роста в части культур (5 из 12) на 5-7 сутки выявлялась популяция клеток, формирующая флотирующие структуры в виде цитосфер двух типов. Начало первому их типу давали неприкрепившиеся клетки, растущие в условиях суспензии (рис. 1, В), второму типу – очаги быстро делящихся фибробластоподобных клеток в монослое (рис. 1, Г), единичные из пролиферировали в суспензии, формируя цитосферы.

Рис. 1. Морфология культивируемых клеток ОВ человека (первичная культура, 7- е сутки in ув.х А - клетки эпителиоподобного морфотипа; Б - фибробластоподобные клетки; В - флотирующие в суспензии цитосферы; Г - очаг быстро делящихся фибробластоподобных клеток в монослое.

В результате фенотипирования популяции культивируемых клеток первичных культур выявлены ГФКБ-, цитокератин 18-, фибронектин - и нестин -положительные клетки. Эти данные свидетельствуют о присутствии в культурах клеток глиальной природы, клетокпредшественников эпителия и фибробластов. Наличие нестин-положительных клеток было характерно для флотирующих цитосфер, что свидетельствует о пролиферации в культуре стволовых и прогениторных клеток.

Таким образом, в течение 10-14 суток культивирования клеток ОВ происходит образование равновесной системы из монослойной и суспензионной частей. При отдельном культивировании клеток цитосфер наблюдается снижение степени их пролиферации в субпассажах, что подтверждает зависимость их функциональной и пролиферативной активности от присутствия других типов клеток ОВ, являющихся продуцентами факторов роста. Это согласуется с данными других исследователей, которые показали, что для культивирования популяции сферообразующих клеток требуется дополнительное внесение ряда ростовых факторов в питательную среду (13).

пролиферируют более 1-2 пассажей, что свидетельствует о их возможной дифференцировке.

Фибробластоподобные клетки ведут себя по иному, при пассировании происходит постепенная селекция клеток по пролиферативной активности и адгезивной способности. Уже на первом пассаже можно отметить, что монослой представлен практически одним морфотипом фибробластоподобных клеток. При фенотипировании клеток 3-его пассажа было установлено, что практически все они экспрессируют маркеры мезенхимальных стволовых клеток CD90 (98,4±0,7%), CD105 (95,3±3,2%) (рис. 2,А, В), белок промежуточных филаментов недифференцированных клеток – нестин (98,7±0,6% (рис. 2, С). При этом до 25-38% клеток экспрессируют маркер гематопоэтических стволовых клеток – CD34 (рис. 2, А), в то же время все клетки отрицательны на CD45 – пан-лейкоцитарный маркер (рис. 2, А). Экспрессия гематопоэтического маркера CD34 при отсутствии на поверхности клеток CD45 исключает возможность контаминации исходного образца ткани гематопоэтическими стволовыми клетками и позволяет идентифицировать 2-й тип стволовых клеток ОВ.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«UNEP/CBD/COP/7/21 Страница 112 Приложение РЕШЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ СЕДЬМЫМ СОВЕЩАНИЕМ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Решение Страница VII/1. Биологическое разнообразие лесов 113 VII/2. Биологическое разнообразие засушливых и субгумидных земель 114 VII/3. Биологическое разнообразие сельского хозяйства 124 VII/4. Биологическое разнообразие внутренних водных экосистем 125 VII/5. Морское и прибрежное биологическое разнообразие 159 VII/6. Процессы проведения оценок 216 VII/7....»

«Материалы VIII Межрегиональной геологической конференции 266 ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ НЕДРОПОЛЬЗОВАНИЯ: ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ПОЧВ К СТРОИТЕЛЬСТВУ СКВАЖИН НА ПРИМЕРЕ ОРЕНБУРГСКОЙ ЧАСТИ ПРЕДУРАЛЬСКОГО КРАЕВОГО ПРОГИБА И.Н. Брежнева1, И.В. Грошев2, И.Е. Клейменова1 1 ООО ВолгоУралНИПИгаз 2 ГОУ ВПО ОГУ В настоящее время прирост российской сырьевой базы углеводородов возможен только за счет вовлечения в разработку новых месторождений, многие из которых находятся в районах с высоким биологическим...»

«The study of the life strategies of bryophytes fortifications Molotov Line (68th fortification) (World War II) in the vicinity of the Avgustov canal. In identified 62 species of mosses, more than half are patients as to the basic life strategy bryophytes in these growing conditions. Сакович А.А., Гродненский государственный университет имени Янки Купалы, Гродно, Беларусь, e-mail: anastasia_pryaz@inbox.ru. Рыковский Г.Ф., Институт экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича, Минск, Беларусь,...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/12 РАЗНООБРАЗИИ 15 February 2006 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20–31 марта 2006 года Пункты 13 и 20 предварительной повестки дня* РЕЗЮМЕ ВТОРОГО ИЗДАНИЯ ГЛОБАЛЬНОЙ ПЕРСПЕКТИВЫ В ОБЛАСТИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ Записка Исполнительного секретаря 1. В пункте 8 а) решения VII/30 Конференция Сторон поручила Исполнительному секретарю при содействии со стороны...»

«Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Студенческий союз МГУ Биологический факультет ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ XIII МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ ЛОМОНОСОВ-2006 12–15 апреля 2006 г. Секция Биология Москва – 2006 УДК 57 Председатель оргкомитета секции Биология Проф. Гостимский С.А. Члены оргкомитета: С.н.с. Ботвинко И.В. Проф. Максимов Г.В. Доц. Медведева М.В. Проф. Соколов Д.Д. Проф. Онищенко Г.Е. С.н.с. Авилова К.В. Ст. преп. Сергеев И.Ю. Доц....»

«Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности Том II Ульяновск - 2013 Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности / - Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. II - 186 с. ISBN 978-5-905970-14-6 Редакционная коллегия: д.б.н., профессор Д.А. Васильев...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/3 РАЗНООБРАЗИИ 19 December 2005 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20-31 марта 2006 года Пункт 9 предварительной повестки дня* ДОКЛАД О РАБОТЕ ОДИННАДЦАТОГО СОВЕЩАНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ОРГАНА ПО НАУЧНЫМ, ТЕХНИЧЕСКИМ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ КОНСУЛЬТАЦИЯМ СОДЕРЖАНИЕ Страница ПУНКТ 1 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ ПУНКТ 2 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ...»

«Труды VI Международной конференции по соколообразным и совам Северной Евразии ОСЕННЯЯ МИГРАЦИЯ СОКОЛООБРАЗНЫХ В РАЙОНЕ КРЕМЕНЧУГСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА М.Н. Гаврилюк1, А.В. Илюха2, Н.Н. Борисенко3 Черкасский национальный университет им. Б. Хмельницкого (Украина) 1 gavrilyuk.m@gmail.com Институт зоологии им. И.И. Шмальгаузена НАН Украины 2 ilyuhaaleksandr@gmail.com Каневский природный заповедник (Украина) 3 mborysenko2905@gmail.com Autumn migration of Falconiformes in the area of Kremenchuh...»

«Международная научно-практическая конференция МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ 26 МАЯ 2014Г. Г. УФА, РФ ИНФОРМАЦИЯ О КОНФЕРЕНЦИИ ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ КОНФЕРЕНЦИИ Цель конференции: поиск решений по актуальным проблемам современной наук и и Клиническая медицина. 1. распространение научных теоретических и практических знаний среди ученых, преподавателей, Профилактическая медицина. 2. студентов, аспирантов, докторантов и заинтересованных лиц. Медико-биологические науки. 3. Форма...»

«:,, 24-26 2010 1 RU/2010/SC/RP/18 Итоговый отчет ВВЕДЕНИЕ И ИСТОРИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ: Концепция биосферного резервата была разработана в 1974 году. Затем в 1995 на Генеральной конференции ЮНЕСКО были приняты Севильская стратегия и Положение о Всемирной сети биосферных заповедников (ВСБЗ) – документы, определяющие порядок создания биосферных резерватов и пересматривающие первоначальную концепцию биосферного резервата. В 2008 г. Третий международный конгресс по биосферным резерватам (БР) и...»

«Известия Коми научного центра УрО РАН Выпуск 3(15). Сыктывкар, 2013. ХРОНИКА ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЕ ЭКОСИСТЕМ КРАЙНЕГО СЕВЕРА: ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ, МОНИТОРИНГ, ОХРАНА С 3 по 7 июня 2013 г. в г. Сыктывкар (Республика Коми) состоялась Всероссийская научная конференция Биоразнообразие экосистем Крайнего Севера: инвентаризация, мониторинг, охрана. Инициатор ее проведения – Институт биологии Коми НЦ УрО РАН. Соучредителями выступили Министерство природных ресурсов и охраны...»

«Научно-издательский центр Априори СОВРЕМЕННАЯ НАУКА: ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ Материалы II Международной научно-практической конференции (30 июля 2012 г.) ТОМ II Сборник научных статей Краснодар 2012 1 УДК 082 ББК 72я431 С 56 Редакционная коллегия: Бисалиев Р.В., доктор медицинских наук, Астраханский государственный технический университет Сентябрев Н.Н., доктор биологических наук, Волгоградская государственная академия физической культуры Церцвадзе М.Г., кандидат филологических наук, Кутаисский...»

«Заповедный край информационный бюллетень заповедника Пинежский Издается с 1997 года № 51 (3) 2013 год *** Я хочу рассказать вам о северном лете С его сказочным лесом, рекой и лугами, По которым чудесно бродить на рассвете, В изумрудной росе утопая ногами. Там целует мне плечи берёзовый ветер. Невидимка-ведунья за пасекой в роще Долгий век накукует, согласно примете. Обещания эти всех чище и проще. Там студёный ручей с родниковой водою Берега украшает лесными цветами. Я бегу вслед за ним на...»

«VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г. ГЕНОФОНД САМООПЫЛЕННЫХ ЛИНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА: РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ 2010 г. Боровикова Т.В. 070512, Казахстан, г. Усть-Каменогорск, п. Опытное поле, ул. Нагорная, 3 ТОО Восточно-Казахстанский научно-исследовательский институт сельского хозяйства vkniish@ukg.kz Приведены результаты изучения биологических и хозяйственных признаков и свойств коллекционных образцов подсолнечника ТОО ВосточноКазахстанский...»

«1-е информационное письмо Федеральное агентство научных организаций Российская академия наук Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Министерство сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности Краснодарского края Министерство образования и науки администрации Краснодарского края ВПРС Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями (МОББ) Российская Технологическая Платформа Биоиндустрия и Биоресурсы – БиоТех2030...»

«Академия наук Республики Татарстан Российская Академия наук Институт проблем экологии и недропользования АН РТ Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Институт экологии растений и животных УрО РАН МАТЕРИАЛЫ Третьей Всероссийской научной конференции (с международным участием) ДИНАМИКА СОВРЕМЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ В ГОЛОЦЕНЕ 12-15 марта 2013 г., Казань, Республика Татарстан, Россия PROCEEDING The Third Russian Scientific Conference with International Participation THE DYNAMICS OF...»

«Геополитика и экогеодинамика Раздел II. регионов. 2009. Т. 5. Вып.1. С. 63-69 ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ЭКОГЕОДИНАМИКИ УДК 911.2 А.И. Лычак, Т.В. Бобра ГЕОЭКОЛОГИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ И ПРОБЛЕМА ФОРМИРОВАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СЕТИ В КРЫМУ Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, г. Симферополь Аннотация. Приведен анализ геоэкологической ситуации в Крыму. Обозначены проблемы сохранения биологического и ландшафтного разнообразия. Описан комплекс перспективных исследований в сфере научного...»

«l=2!,=/ VI b“!%““,L“*%L *%/-*%.-!.,, C% %./ =*!%-,2= chdpnan`mhj` 2005 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина Материалы VI Всероссийской школы-конференции по водным макрофитам ГИДРОБОТАНИКА 2005 Борок, 11—16 октября 2005 г. Рыбинск 2006 ББК 28.082 Материалы VI Всероссийской школы-конференции по водным макрофитам Гидроботаника 2005 (пос. Борок, 11—16 октября 2005 г.). Рыбинск: ОАО Рыбинский Дом печати, 2006. 382 с. ISBN Сборник материалов включает доклады...»

«КОНСАЛТИНГОВАЯ КОМПАНИЯ АР-КОНСАЛТ НАУКА И ОБРАЗОВАНИЕ В СОВРЕМЕННОМ ОБЩЕСТВЕ: ВЕКТОР РАЗВИТИЯ Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции Часть V 3 апреля 2014 г. АР-Консалт Москва 2014 1 УДК 001.1 ББК 60 Н34 Наука и образование в современном обществе: вектор развития: Сборник научных трудов по материалам Международной научнопрактической конференции 3 апреля 2014 г. В 7 частях. Часть V. М.: АРКонсалт, 2014 г.- 152 с. ISBN 978-5-906353-89-4 ISBN...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О UNEP/CBD/COP/7/21 БИОЛОГИЧЕСКОМ 13 April 2004 РАЗНООБРАЗИИ RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Седьмое совещание Куала-Лумпур, 9-20 и 27 февраля 2004 года ДОКЛАД О РАБОТЕ СЕДЬМОГО СОВЕЩАНИЯ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ СОДЕРЖАНИЕ Страница ВВЕДЕНИЕ. ПУНКТ 1 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ Приветственное обращение министра наук и, технологии и окружающей 1. среды Малайзии Дато Сери Ло...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.