WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |

«В сборнике материалов Международной школы-конференции молодых ученых Биотехнология будущего представлены работы, посвященные различным аспектам современной биотехнологии. Вошедшие в ...»

-- [ Страница 1 ] --

Международная Школа-конференция молодых ученых «Биотехнология будущего» организована

Институтом биохимии им. А.Н.Баха РАН в рамках Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-й Рамочной Программе». Школа-конференция проводится

при финансовой поддержке Министерства образования и наук

и РФ, Федерального агенства по

науке и инновациям и INTAS – Международной ассоциации по содействию сотрудничеству с

учеными СНГ.

В сборнике материалов Международной школы-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» представлены работы, посвященные различным аспектам современной биотехнологии.

Вошедшие в сборник работы прошли конкурсный отбор, критериями которого были актуальность, новизна, фундаментальная и практическая значимость исследований.

Работы молодых ученых охватывают различные направления биотехнологии: биотехнология растений и животных, получение и характеристика новых штаммов микроорганизмов и ферментных препаратов, их применение в новых технологических процессах для фармацевтической, пищевой и других отраслей промышленности, а также для целей охраны окружающей среды. Во многих работах рассматриваются вопросы создания новых биоаналитических методов, получения новых материалов и замены традиционных химических технологических процессов биотехнологическими. Результаты, обобщенные в представленных работах, получены с использованием микробиологических и биохимических методов, а также новейших подходов генетики и молекулярной биологии.

ISBN 5-900807-44-4 © Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН,

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АЛАНИНА

И D-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ

Амбарцумян А.А., Алебян М.Г., Дюкова К.Г., Папоян А., Алебян Г.П.

АОЗТ НИИ “Биотехнология” 375056, г. Ереван, ул. Гюрджяна 14, Армения arturhambardzumyan@yahoo.com L-Аланин (L-ала) применяется в медицинской промышленности для производства инфузионных растворов, в пищевой промышленности в качестве пищевой добавки, в химическом синтезе и др. Анализ патентной литературы последних лет показывает наличие неуклонного интереса к этой аминокислоте. В частности, композиция L-аланина с глицином предлагается для лечения гепатита [Yamauchi M., Sonaka I. Patent EP 1249235, 16.10.2002], L-ала предлагается в производстве сыров [Nasr M. Egypt. Journal of Food Science, 1986, 14(2):385-390] a согласно [Van Der Kaaij H., Zink R., Mollet B. Patent EP 1154698, 18.06.2003] L-аланин дегустаторами признан лучшим подсластителем для молочнокислых продуктов типа ''йогурт''. Основным его производителем является Япония.

D-аспарагиновая кислота (D-асп) является важным предшественником одного из синтетических пенициллинов (Аспоксацилина) [Senuma M, Otsuki O, Sakata N, Furui M, and Tosa T, J Ferment Bioengin, 1989, 67(4): 233-237], используется как исходный материал в синтезе оксазинола и производных D-asp, например N-ацил-D-asp, имеющей антиботулинные свойства [Paquet A and Rayman K Can J Microbiol, 1987, 33: 577-582].

Предлогаемая технология одновременного получения L-аланина и D-аспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты состоит из следующих этапов:

– Синтез L-асп из фумаровой кислоты с помощью аспартазы (L-aspartate ammonia-lyase, EC 4.3.1.1) Erwinia aroidea;

– Рацемизация L-асп;

– Превращение L-асп рацемической аспарагиновой кислоты в L-ала с помощью аспартат--декарбоксилазы (L-aspartate 4-carboxy-lyase [EC 4.1.1.12]) Pseudomonas sp.;

– Выделение, очистка и кристаллизация D-асп;

– Выделение, очистка и кристаллизация L-ала.

Синтез L-асп из фумарата аммония с помощью иммобилизованных клеток Escherichia coli с аспартазной активностью в индустриальном масштабе в Японии применяется с 1973 г [Sato, T., Y. Nishida, T. Tosa, and I.

Chibata. Biochim. Biophys. Acta, 1979, 570:179-186]. Нами для синтеза L-асп применялись суспензия свободных клеток Erwinia aroidea с активностью 100000 мкмоль/г сырой биомассы/час выращенных на среде с 2 % соевым гидролизатом и 1 % фумаратом аммония, pH 7,0. Клетки выращивались аэробно, при температуре 30 oC, в течении 22 часов. Клетки пермибилизировались 0,03 % тритоном X-100.

В отличие от американских исследователей [David P., Ian G., Jenifer L., Patent US 5834259, 1998] рацемизацию L-асп проводили выдержкой ее водного раствора, находящегося в герметической тефлоновой капсуле, в бытовой микроволновой печи в течении 2 мин и последующим кипячением в 9 % HCl с обратным холодильником в течении 5 час. За ходом рацемизации следили полярометрически по удельному оптическому вращению.

Существуют несколько хорошо известных технологических схем производства D-асп и L-ала методом декарбоксилирования L-асп из рацемата аспартата [Senuma M, Otsuki O, Sakata N, Furui M, and Tosa T, J.

Ferment Bioengin., 1989, 67(4):233-237]. Все они в той или иной мере являются модифицированными аналогами технологий, разработанных для получения L-ala из L-asp [Takamatsu S., Dewey D. Y. Biotech.

Bioeng., 1988, 32:184-191]. Нами для декарбоксилирования L-асп применялись суспензия свободных клеток Pseudomonas sp. с активностью 20000 мкмоль/г сырой биомассы/час выращенных на среде с 2 % соевым гидролизатом и 1 % глутаматом аммония, pH 7,0. Клетки выращивались аэробно, при температуре 30 oC, в течении 22 часов. Клетки пермибилизировались 0,03 % тритоном X-100. В процессе биотрансформации pH реакционной среды поддерживали в пределах 5,5-5,7 подтитровкой кристаллической DL-асп [G.P. Alebyan, K.G. Dyukova, L.A.Gevorgyan, P. Hovhannesyan, A.A. Hambartsumyan Information Technologies and Management (Armenia) 2003, 4:174-181]. По завершению реакции декарбоксилирования (степень конверсии 99 %) реакционная среда содержала 84 г/л L-аланина и 124 г/л D-аспарагиновой кислоты. Фильтрат полученного раствора обесцвечивали активированным углем (1 час, 50 оC).



Полученный обесцвеченный раствор вакуум выпаривали, подкисляли концентрированной серной кислотой до pH-3,0 и охладили до 5 oC. Осадок D-асп отделяли от раствора, промывали холодной водой, высушивали.

Чистота полученного препарата составляла 98 %. Для получения D-асп чистоты более 99 % перед высушиванием проводили ее перекристаллизацию.

После удаления D-асп раствор обогащенный L-ала предварительно обессоливали на катионообменных смолах в H+-форме. Выпаривание, кристаллизацию и высушивание кристаллов L-ала проводили стандартным методом. Чистота полученного препарата составляла 98 %.

Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта ANSEF Project 05-NS-biotech-0831-446 from Armenian National Science & Education Fund.

ЦЕЛЛЮЛАЗНАЯ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗНАЯ АКТИВНОСТИ СОЛЬВЕНТОГЕННЫХ

КЛОСТРИДИЙ

Березина О.В.

Институт Молекулярной Генетики РАН, 123182, Москва, пл. Курчатова mashchenko@yandex.ru Ключевые слова: Clostridia, сольвентогенные бактерии, гидролиз целлюлозы 1. Введение Политическая нестабильность и рост цен на нефть стимулируют исследования в области развития технологий по производству химических веществ и энергоносителей из возобновляемых природных ресурсов.

Однако, мало кому известно о возможностях, которые открываются при использовании для этих целей микроорганизмов.

Анаэробные бактерии семейства Clostridia производят ценные для химических и энергетических нужд вещества: ацетон, бутанол, этанол и водород [1]. Процесс производства растворителей с помощью клостридий был запатентован Вейцманом в 1916 г. [2]. Вскоре ацетоно-бутиловое производство стало вторым по объему выпускаемой продукции, после процесса получения этанола с помощью дрожжей. Развитие нефтехимической промышленности и повышение цен на субстраты (муку, крахмал) привело к повсеместному сокращению ацетонобутилового производства вплоть до его полного прекращения в 80-х годах прошлого века. В наши дни интерес к сольвентогенным клостридиям вновь возрос благодаря растущей потребности в бутаноле. Бутанол, как жидкий энергоноситель, может частично заменить бензин и дизельное топливо благодаря высокому содержанию энергии, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу и низкой летучести [3]. Для того чтобы сделать ацетонобутиловое брожение экономически выгодным в современных экономических условиях, необходимы сольвентогенные штаммы, растущие на доступном и дешевом сырье, таком как растительная биомасса или отходы сельского хозяйства. В связи с этим важно оценить способность сохранившихся индустриальных штаммов гидролизовать целлюлозные/гемицеллюлозные субстраты. Цель данной работы молекулярная идентификация штаммов клостридий, использовавшихся ранее в промышленности, и характеристика их целлюлазной/гемицеллюлазной активности.

2. Материалы и методы Сольвентогенные индустриальные штаммы Clostridium sp. 6 и Clostridium sp. 7 приобретены в коллекции Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; штамм Clostridium sp. VKPM B- получен из коллекции Государственного научного центра “Гос НИИ Генетика“. Также в работе использовали штаммы Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, C. saccharoperbutylacetonicum DSM 2152, C. acetobutylicum DSM 1732 (NCIB 2951), C. beijerinckii DSM 791 (ATCC 25752, NCIB 9362) и C acetobutylicum ATCC 824. Для культивирования бактерий использовали среды на основе пшеничной муки/травы: 60 г/л пшеничной муки и травы в разных пропорциях, 0,5 г/л цистеин-HCl, pH 6.5. Амплификацию генов 16S рРНК проводили с использованием геномной ДНК клостридий и специфичных бактериальных праймеров [4]. Продукты ПЦP секвенировали, нуклеотидную последовательность анализировали с помощью пакетов программ BLAST и CLUSTALW. Концентрацию ацетона, этанола и бутанола в культуральной жидкости определяли при помощи газовой хроматографии на приборе GC 8000 (Thermofinnigan), оснащенном колонкой Superco SPB 1000 (30 м x 0,53 мм x 0,5 мм). Для анализа целлюлазной/гемицеллюлазной активности были использованы модельные полисахариды: ксилан, карбоксиметилцеллюлоза, аморфная целлюлоза, кристаллическая целлюлоза и бетаглюкан. 0,5%-1% (вес/объем) субстраты инкубировали с концентрированной культуральной жидкостью при 37°C от 10 мин до 24 ч. Содержание редуцирующих сахаров измеряли с помощью динитросалицилового реагента [7]. За одну единицу активности принимали количество фермента, освобождающее 1 µмоль Dглюкозы в минуту.

3. Результаты и обсуждение Определены нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК штаммов Clostridium sp. 6 (Acc.

AM231182), Clostridium sp. 7 (Acc. AM231183) и Clostridium sp. VKPM B-4786 (Acc. AM231184).

Сравнительный анализ последовательностей с генами 16S рРНК из базы данных GenBank показал, что гомология 16S рДНК исследуемых штаммов и Clostridium acetobutylicum ATCC 824 составляет 99%.





Уровень производства растворителей индустриальными и типовыми штаммами клостридий был исследован при 37°C. Индустриальные штаммы, выращенные на 6% мучной среде, существенно превосходили типовые по уровню продукции ацетона, бутанола и этанола и производили 12,7-15 г/л растворителей, при этом 51-56 % от общего выхода составлял бутанол (табл.).

Таблица: Конечная концентрация (г/л) растворителей после ферментации 6% мучной среды Внеклеточную целлюлазную/гемицеллюлазную активность индустриальных и типовых штаммов исследовали на модельных полисахаридах. Ни один из исследуемых штаммов не обладал истинной целлюлазной активностью, тогда как гемицеллюлазная активность (на бета-глюкане и ксилане) индустриальных штаммов была достаточно высока и возрастала при увеличении доли сухой травы в среде для ферментации (Рис.).

Сухая растительная биомасса содержит 15-40 % гемицеллюлоз [6]. Высокая гемицеллюлазная активность сольвентогенных штаммов открывает возможность частичной замены муки на биомассу в традиционных средах для ферментации. Бутанол-производящие штаммы клостридий C. acetobutylicum 6, C. acetobutylicum 7 и C. acetobutylicum VKPM B-4786 могут быть использованы для экономически выгодного и экологически безопасного производства растворителей в России и странах ЕС.

Рисунок: Внеклеточная активность на -глюкане. 1 - Clostridium beijerinckii NCIMB 8052, 2 - C. saccharoperbutylacetonicum DSM 2152, 3 - C. beijerinckii NCIB 9362, 4 – C. acetobutylicum ATCC 824, 5 - C. acetobutylicum 6, 6 - C. acetobutylicum 7, 7 - C. acetobutylicum VKPM B-4786.

4. Заключение Исследована продукция ацетона, бутанола и этанола, у трёх штаммов анаэробных бактерий, идентифицированных нами как Clostridium acetobutylicum. Эти штаммы существенно превосходили типовые по уровню продукции растворителей, причем бутанол составлял 51-56% от общего выхода растворителей.

Изучена активность штаммов на целлюлозе и гемицеллюлозе. Высокая гемицеллюлазная активность C. acetobutylicum 6, C. acetobutylicum 7 и C. acetobutylicum VKPM B-4786 открывает возможность использования дешевой растительной биомассы в средах для культивирования.

Благодарности Работа выполнена при поддержке INTAS Fellowship Grant for Young Scientists. Ref. Nr 03-55-2251. Автор благодарит INTAS и Группу Биотехнологии Микроорганизмов Технического Университета г. Мюнхена за предоставленную возможность реализации проекта.

(1) Jones D. T., Keis S. (1995) FEMS Microbiol Rev, 17, 233-240.

(2) Weizmann C., (1916) Pat. USA № 1 315 585.

(3) Berezina O., Zverlov V. V., Velikodvorskaya G., Schwarz W. (2006) Appl Microbiol and Biotechnol.

(4) Loy A., Lehner A., Lee N., Adamczyk J., Meier H., Ernst J., Schleifer K.H., Wagner M. (2002) Appl Environ Microbiol, 68, 5064-5081.

(5) Ghose, T. K. (1987) Pure Appl. Chem. 59, 257-268.

(6) Logotkin I. S. (1958) Technology of acetone-butanol production (in Russian). Pisshprom Isdat, Moscow.

ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ СТИМУЛИРУЮЩЕЙ РОСТ РАСТЕНИЯ

РИЗОБАКТЕРИЕЙ РОДА AZOSPIRILLUM

Бондаренкова А.Д., Муратова А.Ю.

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, проспект Энтузиастов, 13, Саратов, 410049, Россия ecbio@ibppm.sgu.ru Ключевые слова: фиторемедиация, Azospirillum, нефтяные углеводороды, биодеградация 1. Введение Одним из путей повышения эффективности фиторемедиации почвы, загрязненной органическими веществами, является инокуляция растений стимулирующими их рост ризобактериями (PGPR) и/или активно разрушающими поллютант микроорганизмами (1,2). Бактерии рода Azospirillum – ассоциативные азотфиксирующие ризобактерии, обладающие фитостимулирующими способностями в отношении широкого круга растений (3), но их деструктивный потенциал по отношению к загрязнителям окружающей среды мало исследован. Мы предполагаем, что природное сочетание фитостимулирующих и деструктивных свойств может служить значительным преимуществом азоспирилл перед другими почвенными микроорганизмами, и позволяет рассматривать их как перспективных интродуцентов для фиторемедиации загрязненной почвы.

Целью нашего исследования было изучение деструктивного потенциала ассоциативных ризобактерий рода Azosporillum по отношению к нефтяным углеводородам как широко распространенным загрязнителям окружающей среды.

2. Материалы и методы Тридцать три штамма рода Azospirillum из Коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (Саратов, Россия) были исследованы на способность использовать сырую нефть в качестве источника углерода и энергии в условиях культивирования на агаризованной и в жидкой среде Nfb (4) с добавлением 1% сырой нефти (5). Деструктивную активность исследовали при культивировании азоспирилл в жидкой среде в условиях аэрации на круговой качалке при 130 об./мин., 29 0С, в течение 14 дней. Остаточное содержание нефтяных углеводородов в среде после культивирования определяли гравиметрическим методом после разделения загрязнителя по фракциям с использованием селективной экстракции и колоночной жидкостной хроматографии (6). Деструктивную активность выражали в процентах деградации от исходной концентрации сырой нефти.

Способность штамма A. brasilense SR80 продуцировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) изучали при культивировании микроорганизма в среде Nfb с 0,2 г/л DL-триптофана в качестве предшественника фитогормона. Влияние сырой нефти на продукцию ИУК исследовали, добавляя в среду 0,1 – 20,0 г/л сырой нефти. После культивирования, как описано выше, из нефтесодержащих образцов оставшуюся нефть экстрагировали хлороформом, бактериальные клетки отделяли центрифугированием, супернатант пропускали через мембранный фильтр. В подготовленных таким образом пробах культуральной жидкости определяли содержание ИУК и триптофана с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (4).

Фитостимулирующую активность штамма A. brasilense SR80 на проростках пшеницы изучали, как описано ранее (5).

Все эксперименты ставили в трех повторностях. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel 2003.

3.Результаты и обсуждение Из 33 штаммов рода Azospirillum, исследованных на способность к деградации сырой нефти, 18 показали отчетливый рост на среде Nfb, содержащей яблочную кислоту и 1% сырой нефти (5). Среди протестированных микроорганизмов штамм A. brasilense SR80 был выбран как наиболее активный деструктор, способный разрушать сырую нефть в концентрации 0,1 – 20 г/л. От исходной концентрации 10 г/л штамм разрушал 57% сырой нефти за 14 сут. Cравнение рассчитанной скорости деградации нефти штаммом SR80 (0,41 г/л в сут.) со скоростью, описанной для штаммов родов Rhodococcus (7), Mycobacterium (8), Pseudomonas (9,10) позволяет нам характеризировать A. brasilense SR80 как эффективного деструктора нефти. Подробные исследования показали, что биодеградации подвергались почти все фракции нефти (Рис.1): парафины и нафтены разрушались на 56 и 44 %, соответственно; полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) – на 39%, спиртобензольные смолы – на 22%, а степень деструкции моно – и бициклических углеводородов составила только 7%.

Рисунок 1: Деградация нефтяных фракций штаммом Azospirillum brasilense SR80.

Изучение спектра деструктивной активности штамма показало, что A. brasilense SR80 был способен использовать в качестве источников углерода и энергии и другие углеводородные субстраты, такие как керосин, дизельное топливо, минеральное масло, вазелиновое масло и твердый парафин.

Для выяснения, какие именно компоненты сырой нефти используются азоспириллой в качестве источников углерода и энергии был исследован субстратный спектр штамма SR80 с использованием индивидуальных компонентов представляющих основные классы нефтяных углеводородов. Результаты исследования показали, что углеводороды ряда н-алканов (гексан, гептан, октан, тридекан, гексадекан и гептадекан) являлись наиболее подходящими субстратами для данного штамма. Кроме того, этот микроорганизм был способен разрушать алициклический углеводород декалин, а также моно – и бициклические углеводороды с длиной алифатической цепи более, чем C2.

Будучи деструктором углеводородов, штамм SR80 проявлял способность синтезировать фитогормон ИУК в концентрации 0,024 мг/мл. Установлено, что на продукцию фитогормона не влияло присутствие в среде сырой нефти в концентрации 0,1 – 20,0 г/л. Анализ фитостимулирующей активности штамма показал, что бактеризация 2-сут. проростков пшеницы оказывала положительный эффект на развитие корневой системы растений в присутствии нефти в условиях гидропоники. Полученные данные дают основание полагать, что использование A. brasilense SR80 в качестве инокулянта может стимулировать рост растений, используемых для фиторемедиации нефтезагрязненной почвы. Это предположение в настоящее время проверяется в условиях горшечного эксперимента.

4. Заключение В ходе проведенного исследования были получены приоритетные данные по характеристике деструктивной активности ризобактерий рода Azospirillum по отношению к нефтяным углеводородам.

Результаты показали, что штамм A. brasilense SR80 может быть перспективным инокулянтом растений, используемых для фиторемедиации загрязненных углеводородами почв.

Благодарность Мы выражаем глубокую благодарность к.б.н. Л.И. Поздняковой и к.х.н. О.Е. Макарову (ИБФРМ РАН) за их помощь в выполнении бактериологического и химического анализов. Мы также благодарим Д.Н.Тычинина (ИБФРМ РАН) за его помощь в подготовке английского текста статьи.

Литература (1) Glick B.R. (2003) Biotechnol. Adv., 21, 383–393.

(2) Lucy M., Reed E., Glick B.R. (2004) Antonie van Leeuwenhoek, 86, 1-25.

(3) Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. (2004) Can. J. Microbiol., 50, 521–577.

(4) Dbereiner, J., Baldani, V.L.D. (1979) Can. J. Microbiol., 25, 1264-1269.

(5) Муратова А.Ю. и др. (2005) Микробиология, 74, 2, 248–254.

(6) Рыльков А.В. Методы анализа органического вещества пород, нефти и газа (1977) Ред. Рыльков А.В. Тюмень.:

Западно-Сибирский НИГНИ, 122 с.

(7) Sharma S.L., Pant A. (2000) Biodegradation, 11, 289–294.

(8) Ермоленко З.М. и др. (1997) Микробиология, 66, 5, 650-654.

(9) Wongsa P., Tanaka M., et al. (2004) Cur. Microbiol., 49, 415–422.

(10) Hong J. H. et al. (2005) J. Microbiol. & Biotechnol., 21, 381–384.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТКАНЕВОЙ РЕАКЦИИ НА СИНТЕТИЧЕСКИЕ

ЭНДОПРОТЕЗЫ PROLENE И SPMM И ПРОТЕЗЫ PROLENE И SPMM, ПОКРЫТЫЕ

ФИБРОБЛАСТАМИ

Босхомджиев А.П.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект 33, Россия arab@bk.ru Ключевые слова: биополимеры, патоморфология, сетчатые эндопротезы, герниопластика 1. Введение На сегодняшний день в мире проводятся более миллиона операций по восстановлению грыж. При этом для закрытия грыжевых ворот, используются полимерные сетчатые имплантанты. Однако в настоящее время остро стоит проблема выбора материала используемого для лечения грыж, это связано с высоким разнообразием имплантантов. Наиболее распространенным материалом является сетка из полипропилена, а наиболее перспективным является материал из полигидроксибутирата, обладающий свойствами биосовместимомсти и биоразложения. Но и сами сетки отличаются друг от друга по толщине, размеру пор, плетению, растяжению и другим характеристикам. Перспективными направлениями являются покрытие сетчатых эндопротезов культурами соединительнотканных клеток и биосовместимыми биоразлагаемыми пластиками. Одним из таких пластиков является полигидроксибутират.

В связи с этим в данной работе было решено исследовать тканевую реакцию на два синтетических эндопротеза SPMM и Prolene, а также SPMM и Prolene покрытые фибробластами. Эти сетки размером имплантируются мышам линии Wistar на мышцы спины, таким образом моделируется операция с расположением эндопротеза на апоневрозе. Для оценки имплантатов изучалась тканевая реакция, каждого имплантата с сравнительной характеристикой реакции. Для определения лучшего эндопротеза, в этой работе были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить тканевую реакцию на Prolene и SPMM.

2. Сравнить тканевую реакцию на Prolene и Prolene с фибробластами, а также SPMM и SPMM с фибробластами.

3. Сравнить тканевую реакцию на Prolene и SPMM, покрытых фибробластами.

2. Материалы и методы Объект исследования.

В качестве объекта исследования использовали мышей линии Wistar (массой 18-20 грамм, одного возраста, все самки). Животным имплантировали полипропиленовые эндопротезы размером 1 см2 на апоневротический слой спины.

Для изучения тканевой реакции использовались следующие виды полипропиленовых сеток:

1. Surgipro mesh Auto Suture (SPMM-149) Lot AOJ194, 35x22 см 2. Prolene Ethicon (PMS3) Lot SG5MJPC, 6x11 см Сравнивались выше приведенные сетки и аналогичные сетки, но покрытые аллогенными фибробластами.

Методика имплантирования сеток.

С целью обезболивания мышей вводили предбрюшинно раствор тиопентала натрия. Введение сеток выполнялось в строго асептических условиях. Фиксация полипропиленовых эндопротезов к тканям не проводилась. В послеоперационном периоде наблюдали за состоянием животных. Ни в одном случае не было отмечено отторжения внедренного полипропиленового эндопротеза. Все раны заживали первичным натяжением. На 3, 7, 14 и 28 сутки животных выводили из эксперимента.

Взятие материала для световой микроскопии.

Животных забивали методом растяжения позвонков. Материал, предназначенный для исследования (кожасетка - окружающие ткани), бережно иссекали ножницами. Далее полученный материал помещали в фиксатор 4% формалин. Морфологический метод исследования образцов тканей животных был основным и включал в себя световую микроскопию с морфометрическим исследованием.

После взятия материала, его подвергали стандартной процедуре приготовления препаратов для световой микроскопии, окрашивали гематоксилин-эозином.

3. Результаты и обсуждения Производился подсчет макрофагов, лимфоцитов, фибробластов и лейкоцитов под увеличением х630 в нескольких полях зрения. Данные приведены в графиках ниже.

Прорастание протезирующего материала схоже с первичным заживлением раны. Пролиферация фибробластов, кровеносных сосудов, синтез коллагена – все это этапы одного процесса. Процессы, происходящие при этом, характерны для реакции воспаления.

Синтетический эндопротез SPMM на сроках с 3 по 28 сутки показал в начале тканевую реакцию, которая охарактеризовывалась серозным отеком, исчезающим полностью на 28 сутки. В течение раннего имплантационного периода макрофаги и лимфоциты являются доминирующими клетками.

Соединительнотканные образования появляются на 7 сутки и постоянно повышают свой уровень до 28 суток.

Формирование хорошо выраженной соединительнотканной капсулы вокруг ячеек отмечено на 28 день.

Аналогичные результаты получаются и с сеткой SPMM с фибробластами, с 3 по 28 сутки серозный отек исчезает, а количество фибробластов неуклонно растет. Но сетка, покрытая фибробластами, SPMM в сравнение с их отсутствием на всех сроках является лучше, но не значительно. Это связанно с тем, что сетка, покрытая фибробластами, вызывает реакцию отторжения в меньшей степени. Тканевая реакция с этой сеткой значительно уменьшена, а регенеративные процессы более ускорены.

В сетках Prolene происходит та же ситуация, что и в сетках SPMM тканевая реакция практически идентична, на всех сроках синтетические протезы ведут себя одинаково.

Это объясняется тем, что Prolene и SPMM по своим физическим характеристикам почти сходны (диаметр нити, толщина сетки, размер пор).

Поэтому сетки Prolene и SPMM можно использовать для закрытия и укрепления травматических и хирургических ран, чтобы обеспечить продолжительную поддержку при заживлении раны. Исследования на животных показывают, что имплантация сеток сопровождается легкой транзиторной воспалительной реакцией, которая обусловлена прорастанием фиброзной ткани через поры сетки, таким образом вовлекая сетка погружается в окружающие ткани. Синтетический эндопротез остается мягким и гибким и нормальное заживление раны не ухудшается. Материал не рассасывается и не теряет свойств за счет действия тканевых ферментов.

4. Заключение Тканевая реакция на синтетические эндопротезы Prolene и SPMM одинакова.

Имплантанты Prolene и SPMM можно использовать для закрытия и укрепления грыжевых ворот.

Синтетические эндопротезы покрытые фибробластами вызывают меньшую воспалительную реакцию, с быстрым течением регенеративных процессов.

В связи с этим, в данное время проводится биохимическое и гистологическое изучение тканевой реакции на имплантацию полипропиленовых сеток покрытых биосовместимым биодеградируемым покрытием на основе полигидроксибутирата.

Благодарности Работа выполнена при поддержке ГК № 02.467.11.3004.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛАМИНАРИНАЗ МОРСКИХ МОЛЛЮСКОВ В

НОВЫХ ГИБРИДНЫХ ПОЛИСАХАРИД-СИЛИКАТНЫХ НАНОКОМПОЗИТАХ

Бурцева Ю.В.,1 Щипунов Ю.А.,2 Карпенко Т.Ю.,2 Шевченко Н.М.,1 Звягинцева Т.Н. Институт Биоорганической химии и 2 Институт химии Дальневосточного отделения Российской академии наук, 690022 Владивосток, Россия burtseva@piboc.dvo.ru Ключевые слова: ламинариназы, иммобилизация, гибридные нанокомпозиты 1. Введение К числу наиболее перспективных методов в настоящее время относят иммобилизацию ферментов в процессе золь-гель перехода (1). Достоинством данного метода является то, что включение молекул белка в неорганическую матрицу происходит без образования ковалентных связей между биомолекулами и матрицей.

Ферменты остаются интактными после иммобилизации, они сохраняют свою структуру и активность, что приводит к сохранению и увеличению времени функционирования белков и их температурной стабильности.

Цель данной работы использовать метод иммобилизации для высоко лабильных ферментов ламинариназ. В этой работе детально рассмотрены влиянием состава матрицы на свойства и специфичность ферментов в иммобилизованном состоянии. 1,3--D-Глюканазы (К.Ф.3.2.1.6.) из морских моллюсков Spisula sachalinensis (ЛIV) и Chlamys albidus (ЛО) относятся к О-гликозилгидролазам (К.Ф.3.2.1.) представляют значительный интерес для биотехнологического применения (2-4). Эти ферменты катализируют наряду с гидролизом также трансгликозилирование и глюканозилтрансферазную реакцию.Их трансгликозилирующая активность приводит к синтезу 1,3- и 1,3:1,6--D-глюкоолигосахаридов и гликозидов наряду с разветвленными 1,3:1,6--D-глюканами. Один из -D-глюканов, названный трансламом, в отличие от исходного ламинарана, обладает иммуностимулирующей и антиопухолевой активностью (4-6). Транслам, как высокомолекулярный полисахарид, может применяться для биомедицины (7).

2. Материалы и методы Тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликат (ТГЭОС)(8) является прекурсором. Силикатные нанокомпозиты были синтезированы в водных растворах, содержащих ксилан, локус бин гам или катионные производные гидроксиетилцеллюлозы как было описано в (9). Затем в раствор добавляли фермент. Были изучены два разных по типу действия О-гликозилгидролаз. 1,3--D-глюканаза (ламинариназа, КФ 3.2.1.6) из морского моллюска Chlamys albidus осуществляет переход от биологически неактивного ламинарана в транслам.

Иммобилизация фермента проводилась в соответствии с методикой описанной в работе (10).Общие и восстанавливающие сахара определяли фенол-серным методом (11) и методом Нельсона (12). Определение активности ферментов, характеристика продуктов гидролиза, определение константы Михаэлиса-Ментен и синтез транслама проводили по ранее описанным методам (3,4).

3. Результаты и обсуждение Успех в иммобилизации является следствием преимуществ нового прекурсора и синтезированного биокатализатора. 1) необходимые условия определяются ферментом, а не золь-гель процессами; 2) подобраны рН и температура, требуемая для функционирования фермента; 3) органические растворители не используются для растворения прекурсора; 4) катализаторы для образования золь-гель процесса не добавляются из-за каталитического действия полисахаридов внутри матрицы; 5) биокатализатор может быть приготовлен при меньших концентрациях ТГЭОС, которые уменьшают теплообразование в процессе гидролиза прекурсора; 6) пористая структура матрицы обеспечивает свободный доступ для субстрата иммобилизованного фермента и его функционирования, в то время как белковые молекулы не вымываются из матрицы; 7) иммобилизованные ферменты показывают активность при более низкой концентрации по сравнению с их концентрацией в свободном состоянии.

Данная работа представляет собой продолжение исследования свойств ферментов, находящихся в нанокомпозитных гелях. Показано, что свойства ферментов в растворе и ферментов иммобилизованных в геле практически не отличались. Можно отметить лишь расширение интервала области рН и температурного оптимумов для иммобилизованных ферментов. В процессе иммобилизации происходило значительное увеличение температурной стабильности ЛО по сравнению с ферментом в растворе (рис. 1а). Так, при температуре 37°С фермент, иммобилизованный в геле, терял активность полностью только через 6 ч, а ЛО в растворе –в течение 30 мин (рис. 1б).

Рис. 1. Температурная стабильность 1,3--D-глюканазы LO из Ch. albidus.1 -12°C; 2 - 25°C; 3 - 37°C; a - LO в растворе;

b - LO в иммобилизованном состоянии.

Было показано, что ферменты в растворе и иммобилизованные в гелеимеют схожий состав продуктов гидролиза ламинарана. Константа Михаэлис-Ментен составляет 3 и 4 мг/мл для иммобилизованных глюканаз Лiv и Л0, соответственно, что значительно выше по сравнению с ферментами в растворе (3). Важно выяснить сохраняет ли ламинариназа Л0 способность катализировать глюканозилтрансферазную реакцию после иммобилизации. Для этого мы получили разветвленный 1,3;1,6--D-глюкан, названный нами трансламом, в условиях которые были описаны в работе (4). Для определения продуктов реакции использовали гель проникающую хроматографию (рис. 2, кривая 1) по сравнению с исходным ламинараном (рис. 2, кривая 2).

Рис. 2. Гель хроматография ламинарана из L. cichorioides и транслама на колонке (1,5 30 см) с Superdex 75 HR 10/30. 1) транслам; 2) ламинаран.

Показано, что продукты энзиматической реакции содержат высокомолекулярный продукт с Мм ~ 8 кДа, в то время как ламинаран - Мм ~ 5 кДа (табл. 1). Это означает, что иммобилизованная ламинариназа Л катализирует реакцию трансгликозилирования, приводя к увеличению полисахарида. Результаты представлены в таблице, которая содержит данные по исходному ламинарану. Характеристики транслама соответствуют ранее полученным (4).

Таблица 1. Характеристика ламинарана и транслама, полученные при действии иммобилизованной 4. Заключение Результаты, представленные в работе показывают, что ламинариназы были успешно иммобилизованы в новых гибридных полисахарид-силикатных нанокомпозитных материалов. Они имели максимальную активность в определенных условиях (рН, температуры и ионной силы), что являлось оптимальным для ферментов в растворах до иммобилизации. Кроме того, они обеспечивали аналогичные составные компоненты для синтеза транслама (ламинаран и 1,3--D-глюканазу), в результате получили разветвленный 1,3;1,6--Dглюкан (транслам). В тоже время они сохраняют или увеличивают активность, становятся более термостабильными и показывают увеличение времени жизни. Эти факты дают основание предполагать, что метод иммобилизации идеально подходит для исследованных ферментов и использования биокатализатора для биотехнологических целей.

Благодарности Работа выполнена при поддержке, фонда содействия отечественной науки, грантов президента Российской Федерации и ДВО РАН, РФФИ № 06-04-48540-а и № 05-04-48291-а, Молекулярная клеточная биология.

Литература (1) Gill I., Ballesteros A. (2000) Trends Biothechnol., 18, 282-285.

(2) Solov’eva T.F., et al.: (1996) J. Mar. Technol. Society, 30, 35-39.

(3) Zvyagintseva T.N., Elyakova L.A., (1994) Биоорган. химия, 20, 453-474.

(4) Zvyagintseva T.N., Elyakova L.A., Isakov V.V., (1995) Биоорган. химия, 21, 218-225.

(5) Zvyagintseva et al.: (1997) Acta Phytopathol. Entomol. Hungarica, 32, 59-65.

(6) Ivanushko L.A., et al.: (2001) Antibiot.Chemother., 46, 14-18.

(7) Chihara G., (1984) EOS Rev. Immunol.Immunopharmacol., 4, 85-89.

(8) Meyer, M., Fischer, A., Hoffmann, H. (2002) J. Phys. Chem. B., 106, 1528-1533.

(9) Shchipunov Yu. A. (2003) J. Colloid Interface Sci., 268, 68-75.

(10) Brinker C.J., Scherer G.W., Sol-Gel Science. The Physics and Chemistry of Sol-Gel (1990) Processing, Academic Press, Boston, pp. 180-204.

(11) Dubois M., et al.: (1956) Anal. Chem., 28, 350-356.

(12) Nelson N., (1944) J. Chem., 153, 375-381.

ВОДОРОДНЫЕ ТОПЛИВНЫЕ ЭЛЕКТРОДЫ НА ОСНОВЕ РАЗЛИЧНЫХ ГИДРОГЕНАЗ

Воронин О.Г., Морозов С.В., Карякин А.А.

Химический факультет Московского Государственного Университета им. Ломоносова, 19992, Россия, Москва, тел. 7(095)939- voronin@enzyme.chem.msu.ru Ключевые слова: биоэлектрокатализ, гидрогеназа, водородный ферментный электрод.

1. Введение Одной из наиболее важных проблем современного общества является поиск альтернативных источников энергии. Наиболее перспективным вторичным видом топлива считается водород. Для утилизации энергии реакции окисления водорода предпочтительно использовать электрохимические топливные элементы (ТЭ), поскольку в этом случае достигается наибольшая эффективность конверсии энергии. Однако, в современных водородно-кислородных топливных элементах при конструировании топливных электродов используют платиновые катализаторы. Применение платины приводит к ряду значительных проблем, ограничивающих применение таких топливных элементов (высокая цена, требование дорогого высокоочищенного водорода, ограниченность мировых запасов платины).

Эти проблемы могут быть преодолены при использовании биокатализа. Гидрогеназа (фермент, катализирующий в природе реакции окисления/выделения водорода) может быть использована для катализа электродной реакций окисления водорода. Явление биоэлектрокатализа основано на непосредственном переносе электрона между активным центром фермента и электродом и впервые было продемонстрировано советскими учёными [1]. Как было показано ранее, гидрогеназа не отравляется монооксидом углерода и соединениями серы, содержащимися в дешевом неочищенном водороде [2]. Ферменты являются возобновляемым ресурсом, цена которого может быть значительно уменьшена при помощи генноинженерных методов.

Цель данной работы – исследование характеристик топливных электродов с гидрогеназами из различных источников.

2. Материалы и методы Препараты {NiFe} гидрогеназ из Thiocapsa roseopersicina и {NiFeSe} гидрогеназы из Desulfomicrobium baculatum были нам любезно предоставлены к.б.н. Н.А. Зориным из Института фундаментальных проблем биологии РАН (г. Пущино). Образцы графитовой ткани – основы углеродные тканевые ЛШГ-240 любезно предоставили ВНИИ «Графит (Россия). В качестве электрода использовали полосу 0,5х1см, вырезанную из графитовой ткани. N-метил-N`-(12-пиррол-1-илдодецил)-4,4`-бипиридина гексафторфосфат (MPDBP) был любезно предоставлен проф. С. Косньером (Университет им. Ж. Фурье, Гренобль, Франция).

Полимерное покрытие на графитовой ткани получали электрополимеризацией MPDBP. Затем сорбировали фермент из водного раствора (12 часов, +4оС).

Электрохимические измерения проводились с использованием универсального электрохимического прибора Solartron Shlumberger Model 1286 Electrochemical Interface (Великобритания). Поляризационные кривые записывались гальваностатическим и потенциодинамическим методом с подключением по трехэлектродной схеме. Электродом сравнения служил водородный электрод в том же растворе, что и рабочий.

3. Результаты и обсуждение Водородные ферментные электроды При внесении электрода с иммобилизованной гидрогеназой в насыщенный водородом буферный раствор, на электроде устанавливался потенциал, близкий по значению равновесному водородному потенциалу.

Стационарный потенциал составил 0±1 мВ, что соответствует по значению равновесному водородному потенциалу. Поляризационные кривые для ферментных электродов представлены на рис.1. Анодный ток при положительных перенапряжениях обусловлен окислением молекулярного водорода, тогда как в отсутствие гидрогеназы или водорода в этой области потенциалов токи не регистрируются. При отрицательных перенапряжениях наблюдаются катодные токи выделения водорода [2].

Рис. 1. Поляризационные кривые выделения/поглощения водорода на ферментных электродах.

Самой высокой плотности тока удалось достигнуть для гидрогеназы из D. baculatum.

На основании полученных экспериментальных данных были рассчитаны значения токов обмена (табл.1).

Для сравнения приведено значение тока обмена для платины – лучшего неорганического катализатора окисления водорода.

GSTT1 (делеция), NAT2 (481T>C, 590A>G и 857A>G), MTHFR (677C>T), CYP2C9 (430С>T и 1075C>T) и CYP2C19 (681G>A).

Конструирование биочипа. Блочный подход. Схема биочипа представлена на рис. 1.

Олигонуклеотидные зонды обозначены цифрами, каждой из них соответствует определенная аллель или гаплотип конкретного гена.

28Рисунок 1: Схема “фармакогенетического биочипа”. Ячейки серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям “дикого типа”, ячейки черного цвета – последовательностям “мутантного типа”. Ячейки светло-серого цвета соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям гена CYP1A1 с одной мутацией, а белого цвета – с двумя мутациями. Каждый олигонуклеотид на биочипе продублирован.

Анализ контрольных и диагностических образцов. Специфичность и чувствительность метода.

Микрочип протестирован на 30-ти контрольных и более 100 диагностических образцах. При тестировании контрольных образцов результаты анализа методом ПЦР с последующей гибридизацией на биочипе полностью совпали с данными, полученными другими методами. При анализе диагностических образцов (тестирование на биочипах и методом ПДРФ проводили параллельно), несовпадение результатов обнаружено только в двух случаях из 715-ти проанализированных полиморфных вариантов. Таким образом, специфичность метода гибридизации на биочипах составила 99.7%. Чувствительность биочипа оценивали, проанализировав 40 контрольных образцов с разным количеством исходной геномной ДНК (от 0,1нг до 10мкг). Было показано, что минимальным количеством ДНК, необходимым для однозначной идентификации мутаций, было 10нг.

Разработанный биочип позволяет анализировать 14 мутаций в восьми различных генах. На рис. 2 приведен пример гибридизационной картины, включающей все блоки биочипа.

Создание “кардиочипа”. При создании “кардиочипа” был использован разработанный нами алгоритм создания биочипов. Для выявления генетической предрасположенности к артериальной гипертензии были выбраны полиморфные варианты следующих генов: REN (I9-83G>A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A>C), Рисунок 2: Пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для анализа полиморфизма по генам CYP1A1, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2, MTHFR, CYP2C9 и CYP2C19. Стрелками указаны обнаруженные “мутантные” варианты.

AGTR2 (3123C>A), BKR2 (-58T>C), MTHFR (677C>T), ADRB2 (48A>G и 81C>G). Белковые продукты генов ренин-ангиотензиновой системы (REN, AGT, AGTR1, AGTR2) являются одними из самых важных регуляторов кровяного давления, обеспечивая поддержание жизненно необходимых процессов в организме (8Таким образом, данный биочип позволяет анализировать 8 полиморфных вариантов в семи различных генах (рис. 3).

Рисунок 3: Пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для анализа полиморфизма по генам REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2, MTHFR, ADRB2. Стрелками указаны обнаруженные “мутантные” варианты (овалом выделены такие ячейки).

4. Заключение 1. Предложен алгоритм создания биочипов для анализа генетического полиморфизма человека.

2. Разработаны “фармакогенетический биочип” и «кардиочип».

3. Метод гибридизации на биочипах обладает высокой специфичностью (99%) и может быть предложен для использования при массовом скрининге образцов ДНК.

Благодарность Авторы выражают благодарность Д.В. Прокопенко и Р.А. Юрасову за помощь в обработке результатов, а также С.А. Суржикову, А.В. Чудинову и С.В. Панькову – за синтез олигонуклеотидов, флуоресцентных красителей и изготовление микрочипов.

Литература (1) Kolchinsky A., Mirzabekov A. (2002) Hum. Mutat., 19, 343-360.

(2) Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование. М.: Мир, 480с.

(3) Глотов А.С. и др. (2005) Молекуляр. Биология, 39, 403-412.

(4) Baranov V.S., Ivashchenko T.E., Baranova E.V. (2004) Current pediatrics, 3, 57–61.

(5) Krajinovic M. et al. (2002). Clin. Cancer. Res., 8, 802-810.

(6) Landi S. et al. (2003) Biotechniques, 35, 816-820, 822, 824-827.

(7) Labuda D. et al. (1999) Anal. Biochem., 275, 84-92.

(8) Нефедова Ю.Б., Шварц Е. (1998) Артериальная гипертензия, 4, 63-71.

(9) Naber C.K., Siffert W. (2004) Minerva. Med., 95, 347-356.

ФИТОСТИМУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ SINORHIZOBIUM MELILOTI – ПРОДУЦЕНТА ИУК

И ДЕСТРУКТОРА ПАУ – В ЧИСТОМ И ЗАГРЯЗНЕННОМ ГРУНТЕ

Голубев С.Н.

Институт биохимии и физиологии растений и организмов РАН, 410049, Саратов, проспект Энтузиастов 13, Россия biotech@ibppm.sgu.ru Ключевые слова: фиторемедиация, ПАУ, ризобастерии, ИУК, корневая экссудация 1. Введение Среди биотехнологий, предлагаемых для очистки почв от таких опасных и широко распространенных поллютантов как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), перспективна фиторемедиация, основанная на использовании растений и ассоциированных с ними ризосферных микроорганизмов. Серьезным фактором, ограничивающим эффективность этой технологии, является токсичность поллютантов для растений. Замедление ростовых процессов растений приводит к ослаблению не только их собственного детоксикационного потенциала по отношению к загрязнителю, но и такового у ассоциированной с ними микрофлоры. Совместное использование в качестве инокулянтов растений бактерий-деструкторов и бактерийфитостимуляторов, как показано (1), позволило успешно преодолеть эту проблему. В связи с этим ожидается, что ризобактерии-деструкторы, обладающие стимулирующей рост растений активностью, могут быть более эффективными инокулянтами.

Эта работа сфокусирована на том, чтобы выяснить как проявляется фитостимулирующая активность штамма Sinorhizobium meliloti, являющегося продуцентом индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и деструктором ПАУ, в чистом и загрязненном грунте.

2. Материалы и методы Модельное растение (сорго, Sorghum bicolor L. Moench) культивировали в течение 4 недель в фитотроне:

день/ночь – 14/10 часов; интенсивность света – 450 mol m-2 s-1, температура – 24/20 0С, грунт – кварцевый песок, относительная влажность – 70 %, загрязнитель – фенантрен (10 и 100 ppm). Для бактеризации растений (106 КОЕ/кг грунта) использовали штамм S. meliloti P221, охарактеризованный в работе (2). Контроль за штаммом в грунте осуществляли с помощью иммунодиффузионного анализа и штамм-специфичных антител.

Выживаемость растений в грунте рассчитывали как отношение числа выживших особей к числу исходно засеянных. Вес побегов и корней определяли после высушивания при 70 0С, а площадь поверхности корней – с помощью красителя метеленового синего. Сбор корневых экссудатов проводили согласно (3). Содержание ИУК и аминокислот в ризосферном растворе определяли с использованием ВЭЖХ. Статистический анализ данных проводили с помощью ANOVA 3. Результаты и обсуждение В чистом грунте, обедненном органическими веществами, стимулирующая рост растений способность S. meliloti P221 не проявлялась. На это могло повлиять усиление интенсивности корневой экссудации сорго (на 23 %), связанное с привлечением инокулянта в ризосферу и поддержание там его существования. При этом потери растением органических веществ могли быть очень велики (4). Однако факт снижения сухого веса корней сорго (на 7 %) при поддержании величины площади их поверхности на прежнем уровне в случае интродукции микроорганизма свидетельствовал об изменении морфологии корней. Это коррелировало с увеличением содержания ИУК в ризосфере благодаря фитогормональной активности инокулянта (Рис. 1). Как известно, этот ауксин при концентрации 10-4 – 10-8 М способствуют формированию у растений латеральных корней и корневых волосков, но ингибируют элонгацию корней (5, 6).

Корневая поверхность, Рисунок 1: Зависимость площади корневой поверхности от концентрации ИУК (А) и концентрации фитогормона от содержания триптофана (Б) в ризосфере сорго.

Инокуляция сорго исследуемым микроорганизмом в условиях загрязнения грунта ПАУ способствовала преодолению растениями поллютантного стресса: на 23 % повышалась их выживаемость, на 42 и 20 % соответственно увеличивался прирост наземной и корневой биомассы, на 86 % возрастала площадь корневой поверхности. Изменение последнего параметра являлось, вероятнее всего, следствием фитогормональной активности интродуцента. Подтверждение этому – увеличение содержания ИУК в ризосфере в присутствии S.

meliloti P221, которое линейно зависело от концентрации предшественника фитогормона – триптофана (Рис.

1). Отмеченное при этом снижение содержания в прикорневой зоне сорго данной аминокислоты могло быть связано с утилизацией триптофана микроорганизмом, в том числе и на синтез ИУК (5). В условиях ПАУ загрязнения ключевым моментом фитогормональной регуляции взаимодействий между сорго и S. meliloti P221, возможно, являлся факт значительного снижения количества ризосферной ИУК под влиянием поллютантного давления. По аналогии с моделью стимуляции роста растений при взаимодействии последних с бактериями рода Azospirillum (7), мы предположили, что отмеченное нами изменение могло быть сигналом для усиления бактериального синтеза ИУК, которое впоследствии вызвало увеличение площади корневой поверхности сорго.

Наконец, следует обратить внимание на сокращение интенсивности корневой экссудации у сорго (на 22 %) при его инокуляции штаммом S. meliloti P221 в условиях ПАУ-загрязнения. Это могло благоприятствовать созданию в ризосфере условий для эффективной детоксикации ксенобиотика и стимуляции роста растений за счет снижения концентрации альтернативных источников углерода.

4. Заключение В отсутствие загрязнителя “платой” за долгосрочную продуктивность ассоциации растение-ризобактерии в изменяющихся условиях окружающей среды могло быть некоторое замедление аккумуляции биомассы сорго по сравнению с небактеризованным контролем. В ответ на воздействие загрязнителя растение, сокращая интенсивность корневой экссудации, было способно стимулировать активность S. meliloti P221, результатом которой являлось значительное улучшение выживаемости и ростовых параметров сорго по сравнению с небактеризованным контролем. Следовательно, S. meliloti P221 может стать перспективным инокулянтом растений при фиторемедиации ПАУ-загрязненных почв.

Благодарности За всестороннюю помощь при проведении этого исследования выражаю искреннюю признательность А.

Муратовой, О. Турковской, А. Бондаренковой, Т. Дмитриевой (Институт биохимии и физиологии растений и организмов РАН, Саратов, Россия), Л. Виттенмайеру и В. Мербаху (Институт почвоведения и питания растений, Университет Мартина Лютера, Галле/Заале, Германия).

Литература (1) Huang X.-D. et al. (2004) Environmental Pollution, 130, 465-476.

(2) Голубев С.Н. и др. Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой. (2005) Ред. О.В.

Турковская, Саратов, Научная книга, 112-123.

(3) Egle K., Rmer W., Keller H. (2003) Agronomie, 23, 511-518.

(4) Walker T.S. et al. (2003) Plant Physiology, 132, 44-51.

(5) Dobbelaere S. et al. (1999) Plant and Soil, 212, 155-164.

(6) van Loon L.C. and Bakker P.A.H.M.: Signalling in Rhizobacteria-Plant Interactions. (2003) In: de Kroon H., Visser E.J.W. (Eds.): Ecological Studies. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 168, 297-330.

(7) Lambrecht M. et al. (2000) Trends in Microbiology, 8, 298-300.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ RED-ЗАВИСИМОЙ СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАЦИИ ФАГА ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕК ПРОМОТОРОВ В ENTEROBACTERIACEAE

Голубева Л.И., Куваева Т.М., Каташкина Ж.И.

ЗАО «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика (АГРИ)», Москва 117545, 1-ый Дорожный проезд, д. lesgol@mail.ru Ключевые слова: promoters library, bacteriophage lambda recombination, chromosome engineering, bacteria В настоящее время система Red-зависимой рекомбинации фага (Gene, vol. 246(1-2), pp. 321-30) широко используется для интеграции в хромосому Escherichia coli K12 и Salmonella typhimurium ПЦРамплифицированных фрагментов ДНК. Данная система также применяется для интеграции ПЦРамплифицированных фрагментов ДНК в хромосому таких организмов, как Salmonella enterica Serovar enteritidis (Infect. Immun. Vol.70, p.451-461), Shigella flexneri (Infect. Immun. Vol.69, p. 7471-7480) и Yersinia pseudotuberculosis (FEMS Immun. and Med. Microbiol. Vol. 38, p. 113-116).

Нами был разработан метод, позволяющий за один акт Red-зависимой интеграции получить представительную выборку колоний, имеющих различные уровни экспрессии интересующего гена или оперона. Для демонстрации возможностей метода был проведен эксперимент по рандомизации промоторной области гена lacZ в штамме дикого типа E.coli MG1655. В результате была получена библиотека колоний, несущих перед структурной частью гена lacZ Ptac –подобные промоторы, отличающиеся по четырем внутренним нуклеотидам области «-35» исходного промотора Ptac. Для колоний, отобранных по результатам предварительного скрининга на среде с красителем X-gal, была определена активность -галактозидазы. Было показано, что полученный набор промоторов обеспечивает плавное изменения уровня активности -галактозидазы более чем на два порядка величины. Нуклеотидные последовательности отобранных промоторов были определены по методу Сенгера (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467).

Полученная библиотека промоторов может быть применена как в прикладных, так и в фундаментальных исследованиях для обеспечения изменения уровня экспрессии генов или оперонов в заданное число раз.

Обсуждается возможность использования такого подхода и в других видах Enterobacteriaceae.

РОЛЬ РЕДОКС-МЕДИАТОРОВ В БИОДЕГРАДАЦИИ ГЕРБИЦИДА АТРАЗИНА ГРИБНОЙ

ЛАККАЗОЙ

Горбатова О.Н., Королева О.В.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский проспект, д.33, стр.2, Россия olia77@yandex.ru Ключевые слова: атразин, биодеструкция, редокс-медиатор, лакказа.

1. Введение Постоянно увеличивающиеся объемы отходов производств и жизнедеятельности человека делают актуальными вопросы создания технологий для ремедиации экосистем. Одной из основных групп токсичных загрязнителей окружающей среды являются пестициды, из которых к наиболее широко используемым относятся сим-триазины – атразин и его структурные аналоги (Рис.1), оказывающие негативное воздействие на различные растительные и животные организмы (1, 2). Оптимальным подходом к биотрансформации ксенобиотиков на сегодняшний день представляется использование культур микроорганизмов или ферментных систем совместно с медиаторами, увеличивающими скорость и эффективность деструкции загрязнителя. Целью настоящей работы являлось изучение деструкции атразина системами, содержащими лакказу (грибную оксидоредуктазу) и различные редокс-медиаторы.

Рисунок 1: Атразин и его производные.

2. Материалы и методы Атразин (Атр) и его производные: деэтилатразин (ДЭА), деизопропилатразин (ДИА) и гидроксиатразин (ГА), – производства «Dr. Ehrenstorfer” (Германия, Аугсбург). Комплексы рутения [Ru(phpy)(phen)2]PF6 (К1) и [Ru(bpy)2Cl2]·2H2O (К2) были синтезированы на кафедре химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова (Россия, Москва). Сирингалдазин – стандарт «Sigma» (США), 1-гидроксибензотриазол (ГБТ) – стандарт «Fluka» (Швейцария). Лакказу получали при глубинном культивировании базидиомицета Coriolopsis fulvocinerea (3).

Воздействие медиаторов – ГБТ, сирингалдазина, К1 и К2 – изучали в водных растворах «атразин/редоксмедиатор/лакказа» в течение 10 суток при комнатной температуре (25±2°C), варьируя мольное соотношение «атразин/медиатор» от 9:1 до 1:9. Деструкцию атразина лакказой в присутствии медиаторов характеризовали методом ВЭЖХ по убыли атразина и накоплению продуктов с использованием хроматографической системы “Beckman Coulter” (США).

3. Результаты и обсуждение Стандартные растворы характеризовались следующими временами удерживания в методе ВЭЖХ, мин:

ГБТ – 10,50, ДИА – 16,20, ГА – 17,93, ДЭА – 18,48, сирингалдазин – 22,08, атразин – 24,18, К1 и К2 давали минорные пики при 225 нм. При взаимодействии редокс-медиаторов с лакказой образовывались пики, которые не пересекались с соединениями атразинового ряда. Для определения концентрации атразина была построена калибровочная кривая, которая была линейна в области концентраций от 2 до 110 мкМ.

Экспериментально показано, что лакказа не действует на атразин в отсутствие редокс-медиатора. Из четырех изученных редокс-медиаторов только ГБТ вызывал существенную убыль атразина; в остальных случаях его концентрация снижалась незначительно – до 4%. Полученные результаты можно объяснить высокой скоростью окисления сирингалдазина и комплексов рутения с образованием необратимых продуктов, тогда как ГБТ является электрохимически обратимым соединением (4).

В системе с ГБТ разложение атразина было изучено при различных концентрациях лакказы и разных соотношениях «атразин/медиатор». В табл.1 показана убыль атразина при малой – 0,02 мкМ – концентрации лакказы. Установлено, что убыль атразина возрастала с увеличением концентрации медиатора.

Таблица 1: Убыль атразина в модельной системе «Атр/ГБТ/лакказа».

При отношении ГБТ/атразин, равном 9:1, наблюдалось максимальное уменьшение атразина – до 70% за суток. Для высокой концентрации фермента – 0,97 мкМ – эффективность деструкции атразина была существенно ниже, составляя 28% за 10 суток.

В системе «атразин/ГБТ/лакказа» по данным ВЭЖХ наблюдалось слабое накопление рассмотренных в работе метаболитов атразина. При этом формировались также неидентифицируемые продукты, один их которых может быть предварительно отождествлен как комплекс атразин/ГБТ (Рис. 2). Однако для строгой идентификации и количественного анализа продуктов деструкции необходимо привлечение дополнительных методов, например, GC-MS, что и будет составлять тематику последующих работ.

Рис. 2: Хроматограмма продуктов модельной системы «Атр/ГБТ/лакказа» при 225 нм. 1 – ГБТ, 2 – ДИА, 3 – ДЭА, 4, 5, 7, 8 – неизвестные продукты, 6 – атразин.

4. Заключение Проведено изучение биодеградации атразина в системах, содержащих лакказу и один из медиаторов:

сирингалдазин, ГБТ, К1 или К2. Существенная степень деструкции атразина наблюдалась только для системы «ГБТ/лакказа». При этом для эффективного разложения атразина концентрация медиатора должна в несколько раз превышать концентрацию ксенобиотика.

Областью потенциального применения полученных закономерностей является создание технологий ферментативной детоксификации, прежде всего в водоочистных системах.

Литература (1) Graymore M., Stagnitti F., Allinson G. (2001) Envir. Intern., 26, 7-8, 483–495.

(2) U.S. EPA Office of Pesticide Programs. Health Effect Division. The grouping of a series of triazine pesticides based on a common mechanism of toxicity. (2002). USA, 4–37.

(3) Koroleva-Skorobogat`ko O., Stepanova E., Gavrilova V., Morozova O., Lubimova N., Dzchafarova A., Yaropolov A., Makower A. (1998) J. Biotechnol. Appl. Biochem., 28, 1, 47–54.

(4) Bourbonnais R., Leech D., Paice M.G. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1379, 3, 381-390.

МУТАЦИЯ ЛЕЙДЕНА – ФАКТОР РИСКА РАЗВИТИЯ НЕБЛАГОПРИЯТНОГО ИСХОДА У

БОЛЬНЫХ СЕПСИСОМ

Городнова Е.А.1, Грачев С.В.1, Малов В.А.1, Белобородов В.Б. Московскаямедицинская академия имени И.М. Сеченова, 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.1, НИЦ, Россия;

Российская медицинская академия последипломного образования, 123836, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1.

gorodnova@mmascience.ru, eagorodnova@mail.ru Ключевые слова: сепсис, ДВС синдром, мутация Лейдена, резистентность к активированному протеину С.

1. Введение Сепсис – актуальная проблема медицинского, демографического и экономического значения. Одним из факторов развития осложнений и неблагоприятного исхода у больных сепсисом является тяжесть нарушений в системе гемостаза. Клинически это проявляется синдромом ДВС, морфологической основой которого является мозаичное повреждение эндотелия с микротромбообразованием и кровоизлияниями вокруг мелких сосудов.

При тяжелом сепсисе синдром ДВС приобретает генерализованный характер с множественным образованием тромбов, отложение сгустков фибрина, выстилающих поверхность эндотелия в виде плёнки, что препятствует массообмену и способствует развитию глубоких дистрофических изменений в тканях и органах. В последние годы появись клинические данные, указывающие на генетическую предрасположенность развития синдрома ДВС. Мутация Лейдена является генетически обусловленным дефектом V фактора свёртывания (ФV), заключается в низкой инактивации ФV его физиологическим ингибитором – активированным протеином С (АПС) (состояние резистентности к АПС) и фактором пожизненного риска возникновения тромбозов.

Носители аллеля болезни могут не иметь никакой клинической симптоматики заболевания до появления внешних факторов: иммобилизации, хирургическое вмешательство, травмы, опухоли, приём гормональных препаратов и т.д. В клинической картине доминируют часто рецидивирующие тромботические нарушения различной локализации и их осложнения. При сепсисе резко возрастает риск развития тромбоза и тяжелых необратимых нарушений коагуляции трудно подающихся медикаментозной коррекции. Следствием этого является развитие синдрома полиорганной недостаточности и неблагоприятный исход заболевания.

Целью настоящего исследования явилось изучение клинико-патогенетического значения определения резистентности к АПС ассоциированной с мутацией Лейдена у больных сепсисом различной этиологии.

2. Материалы и методы Исследование является частью работы по изучению клинико-патогенетического значения ингибиторов свёртывания у 33 больных сепсисом. Дизайн исследования: «Случай-Контроль» = 2(23) : 1(10), «Контроль» группа сравнения, CI=95, power=80. «Случай» или основная группа исследования – 23 пациента с менингококковым сепсисом («идеальная» модель сепсиса, вызванного грамотрицательными бактериями), летальность-22%. «Контроль» - 10 пациентов с сепсисом различной бактериальной этиологии, летальностьПациенты (мужчины и женщины) в возрасте от 18 до 75 лет включительно, с диагнозом бактериальный сепсис, подтверждённый лабораторными методами исследования. Критерии исключения: беременность, лактация, вирусный гепатит, цирроз печени, новообразования, патология системы крови (гемофилия), ожирение, хронический диализ, недавняя операция или травма (в пределах предыдущих 12 часов), ранний послеоперационный период, портальная гипертония, наличие в анамнезе тромботических заболеваний, приём эстрогенов, назначение гепарина. Все больные (n=33) – пациенты отделения реанимации и интенсивной терапии, относились к группе тяжёлых больных, средняя оценка по шкале APACHE II на момент включения в исследование составила: 21,5+7,3 балла в группе «Случай», и 25,7+4,3 балла в группе «Контроль». В 100% в группе «Случай» и у части пациентов «Контроля» зарегистрированы проявления ДВС синдрома в виде геморрагической сыпи на коже и слизистых оболочках, кровотечений различной локализации. Для выявления резистентности к АПС нами использовался APCr – Quik test bioMerieux (France), основанный на эффекте действия яда гадюки Рассела, представляющий скрининговый тест для детекции мутации Лейдена. В данном тесте не использовались желтушные, липемические и гемолизированные образцы плазмы, т.к. они могли вызвать ложные результаты. Дефициты факторов VII, VIII, IX, XII не оказывают влияния на результаты APCr – Quik test. Тест проводился на коагулометре Stago–4 Roche (USA) по методике определения АЧТВ. При восстановлении реагентов соблюдались все инструкции фирмы производителя. Результат представляют как выражение: APCr – Quik test = время свёртывания с активатором/ время свёртывания солевое (с физиологическим раствором). Отношение, меньшее и равное 1,5 УЕ, предполагает наличие мутации Лейдена.

Результаты обработаны при помощи пакета прикладных программ SPSS PC (Version 9.0) с использованием библиотеки статистических функций, а так же средствами программы Epi Info 6.0.

3. Результаты и обсуждение Так как течение сепсиса у всех больных характеризовалось как тяжёлое, изменения изучаемых лабораторных показателей было принято рассматривать у больных в зависимости от исхода заболевания, т.е. у выживших и больных с летальным исходом. Как видно из таблицы 1, резистентность к АПС, ассоциированная с мутацией Лейдена, выявлена в 30,5% случаев у больных группы «Случай» и в 40% - у больных «Контроля».

Независимо от этиологии, в случае неблагоприятного исхода заболевания, данный генетический дефект выявлялся в 60% случаев, отражая наличие неблагоприятного преморбидного фона, способствующего развитию ДВС - синдрома тяжелого течения и как следствие – неблагоприятного исхода заболевания.

Мутация Лейдена, % Все случаи летальных исходов у больных сепсисом с мутацией Лейдена выявлены у пациентов старше (47-74) лет. А в группе «Контроль» мутация Лейдена в 100% случаев была зарегистрирована только у лиц мужского пола. У пациентов группы «Случай» данный генетический дефект был обнаружен почти в равных соотношениях как у мужчин (n=4), так и у женщин (n=3), но лица мужского пола всё-таки преобладали.

4. Заключение Настоящее исследование показывает, что в 60% случаев у больных сепсисом с неблагоприятным исходом заболевания, независимо от этиологии, была выявлена Мутация Лейдена. У больных с неблагоприятным исходом данный генетический дефект выявлялся в три раза чаще по сравнению с выжившими больными.

Интересен тот факт, что все случаи летальных исходов у больных сепсисом с мутацией Лейдена выявлены у пациентов старше 40 лет, а носителями данного генетического дефекта чаще были представлены лица мужского пола.

Сепсис являлся фактором, способствующим запуску каскада тяжелых нарушений со стороны системы свёртывания у данных больных, развитию полиорганной недостаточности и летального исхода.

Результаты нашего исследования позволяют полагать, что определение мутации Лейдена у больных сепсисом является дополнительным критерием, объективизирующим оценку степени тяжести одного из компонентов полиорганной недостаточности - ДВС синдрома. Проведённое исследование обосновывает целесообразность определения мутации Лейдена для выбора лечебной тактики коррекции ДВС синдрома у больных тяжелым сепсисом.

Литература (1) Aparicio C., Dahlbck B. (1996) Biochem J.,313, 467-472.

(2) Bajzar L., Kalafatis M., et al. (1996) J Biol Chem., 271, 22949-22952.

(3) Sun X., Evatt B., et al. (1994) Blood, 83, 3120-3125.

(4) Svensson P.J., Dahlback B. (1994) N Engl J Med., 330, 517-522.

(5) Белобородов В.Б.(1997) РМЖ. Том 5. № 24.С.326-338.

(6) Белобородов В.Б., Городнова Е.А. (2006) Клиническая анестезиология и реаниматология. Том 3, №1,С. 45-48.

(7) Городнова Е.А., Пак С.Г. и др. (2004) Вестник РАМН. №6.С.8-13.

(8) Городнова Е.А., Грачев С.В. и др. (2006) Клиническая анестезиология и реаниматология. Том 3, №1, С. 49-55.

ПРОТЕАЛИЗИН – ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ К БИОТЕХНОЛОГИИ

Громова Т.Ю.1, Костров С.В. Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992, Москва, Проспект Вернадского 86, Россия Институт молекулярной генетики РАН, Москва,123182, Площадь Курчатова 2 Россия tgromova81@mail.ru Ключевые слова: коллагеназы, протеализин, термолизинподобные протеиназы.

1. Введение По данным Министерства здравоохранения РФ, белковый дефицит в рационе питания в настоящее время испытывают до 25 (в некоторых регионах до 60) процентов россиян. Одним из наиболее реальных путей его преодоления является повышение пищевой ценности низкосортного мясного сырья. Сортность мяса и качество вырабатываемой из него продукции в первую очередь определяются содержанием коллагена – основного компонента соединительных тканей животных. Разработка и применение ферментных препаратов, способных эффективно расщеплять соединительную ткань, позволит увеличить пищевую ценность и потребительские качества низкосортного мяса и, таким образом, может дать значительный экономический и социальный эффект. Отметим, что такие препараты должны удовлетворять двум основным требованиям. Вопервых, эффективно действовать при температуре 410 градусов, что определяется технологиями приготовления мясопродуктов. Во-вторых, используемые ферменты должны полностью инактивироваться в ходе термообработки.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |
Похожие работы:

«Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Физико-химические исследования. Подраздел: Теплофизические свойства веществ. Регистрационный код публикации: 2tp-b18v Примечание: Публикация является дополненным вариантом статьи, опубликованной в книге “Материалы X Российской конференции по теплофизическим свойствам веществ”. Казань: Бутлеровские сообщения. 2002. С.77-81. Поступила в редакцию 15 декабря 2002 г. УДК 622.276.031:66.061. РАСТВОРЯЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ СВЕРХКРИТИЧЕСКОГО СО К...»

«СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПРИСЕДСКОГО ВАДИМА ВИКТОРОВИЧА 1 Эйдельман Е.Я., Приседский В.В. Номограммы для определения потерь тепла с продуктами горения при отоплении коксовых печей. Кокс и химия, 1964, №4, с.24-28. 2 Эйдельман Е.Я., Приседский В.В. О влиянии длительности периода между кантовками на интенсивность теплопередачи в насадке регенереторов коксовых печей. Кокс и химия, 1965, №9, с.38-42. 3 Гейшин П.А., Приседский В.В. Сушка пасты марганец-цинковых ферритовых порошков, полученных методом...»

«Бюллетень новых поступлений медицинской литературы в библиотеку ВГМУ в ноябре 2011 г. ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами:учеб. пособие для 57 Б 638 вузов/под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева.-3-е изд., испр.-М.:ГЭОТАРМедиа,2005.-441, [4] с.:ил.-(XXI век). Кол-во экз.: 1 МЕДИЦИНА Плавинский, С.Л. Введение в биостатистику для медиков/С.Л. Плавинский.П 37 Открытый институт здоровья.-М.:Новатор,2011.-584 с.:табл. Кол-во экз.: 2 Инновационные технологии в высшем...»

«АЗАСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖНЕ ЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ Ш.УЛИХАНОВ атындаы ККШЕТАУ МЕМЛЕКЕТТІК УНИВЕРСИТЕТІ ШОАН ТАЫЛЫМЫ – 17 атты Халыаралы ылыми-практикалы конференция МАТЕРИАЛДАРЫ 24-26 суір МАТЕРИАЛЫ Международной научно-практической конференции ВАЛИХАНОВСКИЕ ЧТЕНИЯ – 17 24-26 апреля Том 6 Ккшетау, 2013 УДК 001.83 В 17 Валихановские чтения-17: Сборник материалов Международной научноВ 17 практической конференции. – Кокшетау, 2013. – 306 с., Т.6. ISBN 978-601-261-171-7 Бл басылыма 2013 жылды 24-26...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КОЛЬСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ГЕОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ КОЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОГО МИНЕРАЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА ГЕОЛОГИЯ И МИНЕРАГЕНИЯ КОЛЬСКОГО РЕГИОНА Труды Всероссийской (с международным участием) научной конференции и IV Ферсмановской научной сессии, посвященных 90-летию со дня рождения акад. А.В. Сидоренко и д.г.-м.н. И.В. Белькова Апатиты, 4-6 июня 2007 г. Апатиты 2007 УДК 55+553 (470.21) Геология и минерагения Кольского...»

«Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Актуальные аспекты паразитарных заболеваний в современный период Всероссийская конференция Тюмень, 25-26 сентября 2013 года Тезисы докладов Тюмень 2013 УДК 616.9 ББК 52 А 43 А-43 Актуальные аспекты паразитарных заболеваний в современный период : тезисы докладов Всероссийской конференции (25-26 сентября 2013 г., Тюмень). Тюмень, 2013. 208 с. Сборник материалов научной конференции содержит тезисы докладов, в...»

«Фонд имени академика В.И. Смирнова Научный совет РАН по проблемам рудообразования и металлогении Секция наук о Земле РАЕН Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова Геологический факультет Кафедра геологии и геохимии полезных ископаемых Материалы ХХI Международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Владимира Ивановича Смирнова Фундаментальные проблемы геологии месторождений полезных ископаемых и металлогении Москва, МГУ, 26-28 января 2010г....»

«Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Физико-химические исследования. Регистрационный код публикации: 10-19-1-32 Подраздел: Коллоидная химия. Публикация доступна для обсуждения в рамках функционирования постоянно действующей интернет-конференции “Бутлеровские чтения”. http://butlerov.com/readings/ УДК: 546.831:621.3.014. Поступила в редакцию 23 февраля 2010 г. Исследование временных реологических рядов эволюционирующих оксигидратных гелей кремния Сухарев Юрий Иванович,...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБЛАСТНОЙ УНИВЕРСИТЕТ Естественно - экологический институт АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ЭКОЛОГИИ Сборник материалов международной научно-практической конференции, 26 – 29 ноября 2012 г. Москва – 2012 Печатается по решению Ученого совета Естественно-экологического института МГОУ В сборник включены материалы международной научнопрактической конференции Актуальные проблемы биологической и химической экологии,...»

«Приложение 1 НАУЧНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ИНСТИТУТА ВОДНЫХ ПРОБЛЕМ СЕВЕРА КарНЦ РАН за 2006 год Монографии, сборники статей, научные издания 1. Водные ресурсы Республики Карелия и пути их использования для питьевого водоснабжения. Опыт карельско - финляндского сотрудничества. Петрозаводск: КарНЦ РАН. 2006. 263 с. 2. Материалы II Республиканской школы-конференции молодых ученых Водная среда Карелии: исследование, использование, охрана. Петрозаводск: КарНЦ РАН. 2006. 107 с. 3. Материалы юбилейной...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Учреждение Российской Академии Наук Институт геологии и геохимии имени академика А.Н. Заварицкого Уральская секция Научного Совета по проблемам металлогении и рудообразования Уральский петрографический совет Горнопромышленная ассоциация Урала V УРАЛЬСКИЙ ГОРНОПРОМЫШЛЕННЫЙ ФОРУМ КОЛЧЕДАННЫЕ МЕСТОРОЖДЕНИЯ – ГЕОЛОГИЯ, ПОИСКИ, ДОБЫЧА И ПЕРЕРАБОТКА РУД 1-5 октября 2013 МАТЕРИАЛЫ ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУЧНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ V Чтения памяти С.Н. Иванова Екатеринбург...»

«Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Физико-химические исследования. Регистрационный код публикации: 11-25-6-86 Подраздел: Коллоидная химия. Публикация доступна для обсуждения в интернет как материал “Всероссийской рабочей химической конференции “Бутлеровское наследие-2011”. http://butlerov.com/bh-2011/ УДК 543.544.4:543.635.62. Поступила в редакцию 19 апреля 2011 г. Аналитические возможности мицеллярно-каталитических реакций образования азосоединений в системах: ариламины –...»

«ISSN 1563-0331 Индекс 75879; 25879 Л-ФАРАБИ атындаы АЗА ЛТТЫ УНИВЕРСИТЕТІ азУ ХАБАРШЫСЫ Химия сериясы КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени АЛЬ-ФАРАБИ ВЕСТНИК КазНУ Серия химическая AL-FARABI KAZAKH NATIONAL UNIVERSITY KazNU BULLETIN Chemistry series № 3 (65) МАТЕРИАЛЫ III МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ КОЛЛОИДЫ И ПОВЕРХНОСТИ Алматы аза университеті Основан 22.04.1992 г. Регистрационное свидетельство № Редакционная коллегия: д.х.н., профессор Буркитбаев М.М. (науч.редактор) д.х.н., доц. Онгарбаев...»

«PIC Роттердамская конвенция Роттердамская (PIC) конвенция Всемирное соглашение по контролю за международной торговлей отдельными опасными химическими веществами •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• Гамбург 2003 Авторы выражают благодарность тресту Rausing и организации Novib за поддержку деятельности PAN Германии, связанной с Роттердамской (PIC) конвенцией, Стокгольмской (POPs) конвенцией и кодексом ФАО Pestizid Aktions-Netzwerk e.V. (PAN Germany) Nernstweg 32, D-22765...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.